小膠質(zhì)細胞原代培養(yǎng)實驗
| 實驗方法原理 | 利用混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物分層生長，以及小膠質(zhì)細胞半懸浮生長的原理，通過搖床震蕩法，將皮層來源的混合膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物最上層的小膠質(zhì)細胞震搖下來繼續(xù)培養(yǎng)，達到分離和純化小膠質(zhì)細胞的目的。 |
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| 實驗材料 | |
| 試劑、試劑盒 | |
| 儀器、耗材 | |
| 實驗步驟 | 1按照培養(yǎng)少突膠質(zhì)細胞的方法，待10d后細胞分層生長。顯微鏡下可見滿視野圓形、折光性強的小膠質(zhì)細胞，附著在貼壁生長、緊密連接在一起、鋪滿培養(yǎng)瓶的星形膠質(zhì)細胞層上面，甚至可見許多圓形小膠質(zhì)細胞飄落在培養(yǎng)液中，此時可以開始純化。 2.將培養(yǎng)瓶固定到37℃恒溫搖床上，80-200r/min,振搖2h左右。 3收集振搖下來的小膠質(zhì)細胞，種植到多聚賴氨酸包被的培養(yǎng)皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3d換液1次。 4.小膠質(zhì)細胞在體外較難進一步分裂增殖，但如果根據(jù)實驗需要傳代培養(yǎng)，一種方法可以直接用細胞刮子刮下細胞，接種到新的培養(yǎng)皿中；另一種方法就是用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后，進行傳代。此方法獲得的小膠質(zhì)細胞，純度可達90%-95%以上，可以用小膠質(zhì)細胞特異性標志物F4/80、IBA1和IB4等進行免疫細胞化學染色進行鑒定。相差顯微鏡下觀察，靜息狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞形態(tài)呈短小桿狀或細長梭形等形態(tài)，帶有2個或以上突起，折光性強，但是在激活和發(fā)揮吞噬功能狀態(tài)下，小膠質(zhì)細胞形態(tài)可發(fā)生巨大變化，胞體變大、變長或者變圓（圖I--5)。
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| 注意事項 | 1.所有步驟要無菌操作．否則小膠質(zhì)細胞有被污染或被微生物及毒素激活的可能。 2在振搖細胞之前，一定要確保底層的星形膠質(zhì)細胞鋪滿培養(yǎng)瓶，并緊密連在一起，否則振搖過程中會將星形膠質(zhì)細胞層搖起。 |
| 其他 | 1.振搖分離出小膠質(zhì)細胞后，將新的培養(yǎng)液加入原培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，數(shù)天后又會出現(xiàn)大量的小膠質(zhì)細胞，如此可以重復甚至更多次振搖收集小膠質(zhì)細胞。 2.由于小膠質(zhì)細胞數(shù)目所占比例較小，在體外較難分裂增殖，故其產(chǎn)最不高。有文獻報道可以采用營養(yǎng)缺失法或加入單核細胞集落刺激因子(M-CSF)以增加產(chǎn)量。作者在培養(yǎng)過程中加入了15%-30%L929條件性培養(yǎng)基。L929是一種成纖維細胞系，由于其分泌M-CSF,結(jié)果可獲得充足的小膠質(zhì)細胞。 |
