肉毒梭菌及其檢驗
一、肉毒梭菌
1、生物學狀性
肉毒梭菌屬于厭氧性梭狀芽胞桿菌屬，具有該菌的基本特性，即厭氧性的桿狀菌，形成芽胞，芽胞比繁殖體寬，呈梭狀，新鮮培養(yǎng)基的革蘭氏染色為陽性，產生劇烈細菌外毒素，即肉毒毒素。
肉毒梭菌為多形態(tài)細菌，約為4×1μm的大桿菌，兩側平行，兩端鈍園，直桿狀或稍彎曲，芽胞為卵圓形，位于次極端，或偶有位于中央，常見很多游離芽胞。有時形成長絲狀或鏈狀，有時能見到舟形、帶把柄的檸檬形、蛇樣線裝、染色較深的球莖狀，這些屬于退化型。當菌體開始形成芽胞時，常常伴隨著自溶現(xiàn)象，可見到陰影形。
肉毒梭菌具有4-8根周毛性鞭毛，運動遲緩；沒有莢膜。
在固體培養(yǎng)基表面上，形成不正圓形，大約3毫米左右的菌落。菌落半透明，表面呈顆粒狀，邊緣不整齊，界線不明顯，向外擴散，呈絨毛網狀，常常擴散成菌苔。在血平板上，出現(xiàn)與菌落幾乎等大或者較大的溶血環(huán)。在乳糖卵黃牛奶平板上，菌落下培養(yǎng)基為乳濁，菌落表面及周圍形成彩虹薄層，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周圍出現(xiàn)透明環(huán)。
肉毒梭菌發(fā)育最適溫度為25-35℃，培養(yǎng)基的最適的酸鹼度為pH6.0-8.2。
肉毒梭菌的生化性狀很不規(guī)律，即使同性，也常見到株間的差異。（見表1）
表1 各型肉毒梭菌的生化反應
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型 別 ? 反 應 | ? A | ? B | ? C | ? D | ? E | ? F |
? 葡萄糖發(fā)酵 麥芽糖發(fā)酵 乳糖發(fā)酵 蔗糖發(fā)酵 靛基質產生 膽膠液化 牛奶消化 ? |
＋ ＋ － （±） － （＋） ＋ | ? ＋ ＋ － （±） － （＋） （±） | ? ＋ （±） － （±） （－） （±） － | ? ＋ （±） （－） （±） （－） （±） － | ? ＋ （＋） － （±） － （±） － | ? ＋ ＋ － （±） － （＋） （＋） |
?
注：+陽性反應；-陰性反應；（±）視菌株而異；（+）多為陽性反應；（-）多為陰性反應。
2、肉毒梭菌的致病性
肉毒梭菌的致病性在于所產生的神經毒素即肉毒毒素，這些毒素能引起人和動物的肉毒中毒，根據(jù)肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C（1、2）、D、E、F、G等七個型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型毒素主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌極少分離，未見G型菌引起人群的中毒報道。
3、流行病學
肉毒梭菌廣泛存在于自然界，引起中毒的食品有臘腸、火腿、魚及魚制品和罐頭食品等。在美國以罐頭發(fā)生中毒較多，日本以魚制品較多，在我國主要以發(fā)酵食品有關，如臭豆腐、豆瓣醬、面醬、豆豉等。其它也引起中毒的食品還有：熏制未去內臟的魚、填餡茄子、油浸大蒜、、烤土豆、炒洋蔥、蜂蜜制品等。
肉毒梭菌是致死性最高的病原體之一。感染劑量極低，每個人都易感。攝食18-36小時后發(fā)病為典型病癥，但不典型的可在4小時至8天不等。癥狀為虛弱、眩暈、伴隨視覺成雙、漸進性說話障礙、呼吸和吞咽困難。也許會出現(xiàn)腹脹和便秘。毒素最終引起麻痹，呈漸進對稱性、自上到下
肉毒梭菌在自然界的分布上具有某種區(qū)域性差異，顯示出生態(tài)上的差別傾向。A、B型的分布最廣其芽胞廣泛分布于自然界，各大洲的許多國家均有檢出，；C、D型的芽胞一般多存在于動物的尸體中，或在腐尸附近的土壤中；E型菌及其芽胞存在于海洋的沉積物、水產品的腸道內，E型菌及其芽胞適應于深水的低溫，使E型菌在海洋地區(qū)的廣泛分布。但是，越來越多的調查結果表明，除G型菌之外，其它各型菌的分布都是相當廣泛的。
二、肉毒毒素
1、生物學性狀
肉毒梭菌的致病性在于其產生的神經麻痹毒素，即肉毒毒素，而細菌本身則是一種腐生菌。各個型的肉毒梭菌分別產生相應的毒素，所以，肉毒毒素也分為A、B、C、D、E、F、G等七個型。C型包括C1、 C2二個亞型。
A型毒素經60℃2分鐘加熱，差不多能被完全破壞，而B、E二型毒素要經70℃2分鐘才能被破壞；C、D二型毒素對熱的抵抗更大些；C型毒素要經過90℃2分鐘加熱才能完全破壞，不論如何，只要煮沸1分鐘或75℃加熱5-10分鐘，毒素都能被完全破壞
肉毒毒素對酸性反應比較穩(wěn)定，對堿性反應比較敏感。某些型的肉毒毒素在適宜條件下，毒性能被胰酶激活和加強。
2、致病性
肉毒毒素的毒性極強，是最強的神經麻痹毒素之一，據(jù)稱，精制毒素1微克的毒力為200，000小白鼠（20克）致死量，也就是說，1克毒素能殺死400萬噸小白鼠，一個人的致死量大概1微克左右。
3、流行病學
肉毒中毒是由于誤食含有肉毒毒素的食品而引起的純粹的細菌毒素食物中毒。人的肉毒中毒發(fā)生并不多，但是發(fā)病急、病程發(fā)展快、病死率高。肉毒中毒是毒素中毒，潛伏期較短，一般為6至36小時，最長60小時。主要癥狀有：視力減弱、全身無力、伸舌和張口困難、抬頭費力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。
據(jù)統(tǒng)計，1899年至1990年，在美國共有2305人中毒，經檢測，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人感染E型毒素，2人感染F型毒素，有2起中毒事件是由A、B二種毒素引起。F、G二種毒素，主要引起動物肉毒中毒，尚未深入得到研究。
重癥患者，如果不及時治療和抗毒素特異治療，多在2至4天死亡。肉毒梭菌生長和產毒的最適溫度是25至30℃，而在人的體溫條件下細菌表現(xiàn)為絲狀，幾乎不能產毒、芽胞也不會發(fā)芽。
肉毒中毒一年四季均可發(fā)生，發(fā)病主要與飲食習慣有著密切關系。歐美國家主要的中毒是由于肉類食品、罐頭食品引起；日本等沿海國家主要的中毒是由于進食水產品引起；我國內地的中毒主要是由于進食發(fā)酵食品（如：臭豆腐、豆瓣醬、豆豉等）引起的。
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三、肉毒毒素檢出及肉毒梭菌檢驗
A、肉毒毒素的檢出
肉毒中毒的診斷，重要的是毒素的檢出及定型；罐頭食品的細菌學檢驗，有時需要證實肉毒梭菌的存在，不過，最終還是要根據(jù)產毒試驗來鑒定細菌及其型別。
B、肉毒毒素檢測的主要程序
1.初步的定性試驗----小白鼠腹腔注射法
檢驗樣品經適當處理后取上清夜，用明膠磷酸緩沖液稀釋（1：5、1：10、1：100三個稀釋度）后各取0.5毫升腹腔注射小白鼠；另取上清夜100℃10分鐘加熱后注射小白鼠；另取上清夜經胰酶處理后注射小白鼠；每個注射樣注射二只小白鼠；注射后，定時觀察小白鼠，連續(xù)觀測48小時；排除24小時后死亡的白鼠和無癥狀死亡的小白鼠；48小時后，如果除了經熱處理后再注射樣品的小白鼠未死亡，其余小白鼠均死亡的情況，重復試驗，增加稀釋倍數(shù)，計算最底致死量。并進行抗毒素中和試驗。
2.中和試驗
用無菌生理鹽水溶解凍干的抗毒素，，取A、B、E、F四種抗毒素注射于小白鼠體內；同時取未注射抗毒素的小白鼠做對照；注射抗毒素30分鐘或1小時后，注射不同稀釋度（覆蓋10、100、1000倍最小致死量）的含毒素樣品，觀察48小時，如發(fā)現(xiàn)毒素未被中和，再取C、D型抗毒素和A-F多價抗毒素重復上述試驗；如小白鼠死亡，應將含毒素樣品稀釋后再重復以上試驗。
3．試驗的幾個注意事項
3.1典型的肉毒中毒，小白鼠會在4至6小時內死亡，而且98-99%的小白鼠會在12小時內死亡，因此，試驗前24小時內的觀察是非常重要的。
3.2 24小時后的死亡是可疑的，除非有典型的癥狀出現(xiàn)。
3.3如果小白鼠注射經1：2或1：5倍數(shù)稀釋的樣品后死亡，但注射更高稀釋度的樣品后未死亡，這也是非常可疑的現(xiàn)象，一般為非特異性死亡。
3.4小白鼠要用不會抹去的顏料加以標記。
3.5小白鼠的飼料與水必須及時添加、充分供應。
4.結果分析
4.1食物中發(fā)現(xiàn)毒素，表明未經充分的加熱處理，可能引起肉毒中毒。
4.2檢出肉毒梭菌，但未檢出肉毒毒素，不能證明此食物會引起肉毒中毒。
4.3肉毒中毒的診斷必須以檢出食物中的肉毒毒素為準。
4.4中和試驗可以為毒素定型。
C、肉毒梭菌的檢驗與分離鑒定
肉毒梭菌檢驗方法的重點乃是產毒及毒素的檢出試驗，如要證實是否有肉毒梭菌存在，只要分離、培養(yǎng)、毒素鑒定即可。
1.前增菌
樣品分別接種于皰肉培養(yǎng)基、TPGYT培養(yǎng)基，并分別與35、26℃培養(yǎng)7天。
2.分離
培養(yǎng)7天后，染色、鏡檢，觀察菌的形態(tài)是否為典型的肉毒梭菌。取1-2毫升培養(yǎng)物加等量的酒精混合（或80℃加熱10分鐘，）后在室問溫下培養(yǎng)1小時，非蛋白分解型的肉毒梭菌，因其芽胞不耐熱，不要采取熱處理的方法。
用接種環(huán)涂劃酒精處理液或熱處理的培養(yǎng)物于小牛肝卵黃瓊脂或厭氧卵黃瓊脂平板上，厭氧培養(yǎng)48小時，35℃。
典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黃培養(yǎng)基上用斜光檢驗時菌落表面通常出現(xiàn)虹暈色（iridescence）,此光區(qū)稱為“珍珠層”，C、D、E型菌通常有2-4毫米黃色沉淀區(qū)圍繞，A、B型菌通常顯示較小的沉淀區(qū)。
挑取10個典型菌落，分別接種于皰肉培養(yǎng)基、TPGYT培養(yǎng)基，并分別與35、26℃培養(yǎng)7天，再取培養(yǎng)物按照1.2.1、1.2.2的方法進行肉毒毒素的檢測即可。
生化反應試驗，可以為鑒定做參考，以上肉毒梭菌的培養(yǎng)、分離、鑒定試驗力求迅速，不要長時間接觸空氣，最好在厭氧條件下操作。
四、控制：
最根本的預防方法是加強食品衛(wèi)生管理，改進食品的加工、調制及儲存方法，改善飲食習慣，對某些水產品的加工可采取事先取內臟，并通過保持鹽水濃度為10%的腌制方法，并使水活度低于0.85或pH為4.6以下，以及對于在常溫儲存的真空包裝食品采取高壓殺菌等措施，以確保抑制肉毒梭菌產生毒素，杜絕肉毒中毒病例的發(fā)生。
