核酸檢測革命：可替代PCR的犀利技術(shù)——RPA
自PCR技術(shù)誕生以來已經(jīng)有三十年了，從經(jīng)典PCR、實(shí)時(shí)定量PCR再到現(xiàn)在的數(shù)字PCR，這一技術(shù)在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。很多人的實(shí)驗(yàn)根本離不開PCR。筆者曾經(jīng)也接觸PCR很長一段時(shí)間，加樣、設(shè)置程序、等待、檢測。這些過程看起來容易，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果卻總是會(huì)出人意料，很多時(shí)候根本不知道是哪里出了錯(cuò)。那么要是有一款技術(shù)，它比PCR更快速、便捷、高效，你會(huì)感興趣嗎？
RPA是什么？
基本原理
重組酶聚合酶擴(kuò)增（Recombinase Polymerase Amplification，RPA），被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術(shù)。RPA技術(shù)主要依賴于三種酶：能結(jié)合單鏈核酸（寡核苷酸引物）的重組酶、單鏈DNA結(jié)合蛋白（SSB）和鏈置換DNA聚合酶。這三種酶的混合物在常溫下也有活性，最佳反應(yīng)溫度在37°C左右。
重組酶與引物結(jié)合形成的蛋白-DNA復(fù)合物，能在雙鏈DNA中尋找同源序列。一旦引物定位了同源序列，就會(huì)發(fā)生鏈交換反應(yīng)形成并啟動(dòng)DNA合成，對模板上的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行指數(shù)式擴(kuò)增。被替換的DNA鏈與SSB結(jié)合，防止進(jìn)一步替換。在這個(gè)體系中，由兩個(gè)相對的引物起始一個(gè)合成事件。整個(gè)過程進(jìn)行得非常快，一般可在十分鐘之內(nèi)獲得可檢出水平的擴(kuò)增產(chǎn)物。
引物設(shè)計(jì)
RPA分析的關(guān)鍵在于擴(kuò)增引物和探針的設(shè)計(jì)。PCR引物多半是不適用的，因?yàn)镽PA引物比一般PCR引物長，通常需要達(dá)到30-38個(gè)堿基。引物過短會(huì)降低重組率，影響擴(kuò)增速度和檢測靈敏度。在設(shè)計(jì)RPA引物時(shí)，變性溫度不再是影響擴(kuò)增引物的關(guān)鍵因素。RPA的引物和探針設(shè)計(jì)不像傳統(tǒng)PCR那樣成熟，用戶需要自己摸條件進(jìn)行優(yōu)化。
優(yōu)勢
常規(guī)PCR必須經(jīng)過變性、退火、延伸三個(gè)步驟，而PCR儀本質(zhì)上就是一個(gè)控制溫度升降的設(shè)備。RPA反應(yīng)的最適溫度在37℃-42℃之間，無需變性，在常溫下即可進(jìn)行。這無疑能大大加快PCR的速度。此外，由于不需要溫控設(shè)備，RPA可以真正實(shí)現(xiàn)便攜式的快速核酸檢測。
據(jù)介紹，RPA檢測的靈敏度很高，能夠?qū)⒑哿康暮怂幔ㄓ绕涫荄NA）模板擴(kuò)增到可以檢出的水平，從單個(gè)模板分子得到大約1012擴(kuò)增產(chǎn)物。而且RPA還用不著復(fù)雜的樣品處理，適用于無法提取核酸的實(shí)地檢測。
RPA既可以擴(kuò)增DNA也可以擴(kuò)增RNA，還省去了額外的cDNA合成步驟。你不僅可以對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行終點(diǎn)檢測，還可以對擴(kuò)增過程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，甚至可以通過試紙條（側(cè)流層析試紙條LFD）讀取結(jié)果。
RPA可以用來干什么？
RPA對硬件設(shè)備的要求很低，特別適合用于體外診斷、獸醫(yī)、食品安全、生物安全、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。以下為大家介紹RPA在細(xì)菌、病毒檢測以及癌癥研究等領(lǐng)域的應(yīng)用情況。
RPA成為致病菌檢測的得力工具
在今年發(fā)表的一系列文章中，RPA技術(shù)被廣泛用于艱難梭狀芽孢桿菌、結(jié)核桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA、淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門氏菌、大腸埃希菌STEC等常見致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面，為人們提供了簡單快速的實(shí)地篩查方案。（這篇文獻(xiàn)之前網(wǎng)站報(bào)道過，在這里就不詳述了。）
RPA技術(shù)建立沙眼衣原體快速檢測方法
沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis）感染是最常見的性傳播疾病之一。沙眼衣原體影響5-10%的人口，常見于小于25歲的成年人。目前廣泛使用的沙眼衣原體檢測方法是以聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)為基礎(chǔ)，這種方法只適合于經(jīng)過專業(yè)訓(xùn)練的人員在具有特定儀器的實(shí)驗(yàn)室使用。
日前，發(fā)表在《分子診斷雜志》（The Journal of Molecular Diagnostics）雜志上的一項(xiàng)研究中，研究人員利用RPA技術(shù)開發(fā)了一種檢測沙眼衣原體的快速、靈敏的新方法，利用該方法在20分鐘內(nèi)即可得出檢測結(jié)果。[參考文獻(xiàn)]
研究人員利用RPA技術(shù)直接從患者尿液樣本中檢測沙眼衣原體，不需要從尿液樣品提取總DNA，也不需要專門的儀器設(shè)備。而且該檢測方法還具有少費(fèi)力、少耗時(shí)、更經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn)。與目前的沙眼衣原體檢測方法比較而言，該方法還能夠顯著提高檢測的敏感性和特異性
RPA檢測瘧原蟲
澳大利亞科學(xué)家首次捕捉到瘧原蟲入侵并摧毀人體紅細(xì)胞畫面
核酸擴(kuò)增是目前最靈敏的瘧原蟲（P. falciparum）特異性檢測法。然而，PCR需要熱循環(huán)設(shè)備和專業(yè)性操作，資源匱乏的地區(qū)往往難以滿足這些條件。在這種情況下，與側(cè)流層析結(jié)合的RPA有著很大的應(yīng)用前景。
《Malaria Journal》雜志今年三月份發(fā)表的一項(xiàng)研究中，研究人員將RPA基礎(chǔ)反應(yīng)、TwistAmp nfo探針和側(cè)流層析結(jié)合起來，實(shí)現(xiàn)了瘧原蟲18S rRNA基因的高靈敏度快速檢測。在38°C的條件下，只需要不到十分鐘的擴(kuò)增，就能檢出含有四個(gè)瘧原蟲的樣本。加上側(cè)流層析的檢測時(shí)間，整個(gè)流程總共只需要15分鐘，而且肉眼可以直接看到檢測結(jié)果。
研究人員用不同瘧原蟲測試了這種方法的靈敏度和特異性。研究顯示，所有瘧原蟲都被成功檢出，所有非瘧原蟲都得出了陰性結(jié)果。文章指出，這一方案將大大改善資源匱乏地區(qū)的瘧原蟲分子診斷。[參考文獻(xiàn)]
RPA檢測冠狀病毒
2012年在中東首次鑒定的中東呼吸綜合癥冠狀病毒( Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV)是一種新型的冠狀病毒。這種病毒很快傳入了歐洲，給公共安全機(jī)構(gòu)敲響了警鐘。
目前，MERS-CoV檢測主要依賴于實(shí)時(shí)RT-PCR，需要收集患者樣本然后到專門的實(shí)驗(yàn)室去檢驗(yàn)。因此，亟需能夠進(jìn)行實(shí)地檢測的快速裝置。
《PLOS Currents：Outbreaks》去年十二月發(fā)表的一項(xiàng)研究，開發(fā)了一個(gè)能在3-7分鐘內(nèi)鑒定MERS-CoV的便攜式RT-RPA裝置。在42°C條件下，等溫MERS-CoV RT-RPA與實(shí)時(shí)RT-PCR一樣敏感，可檢出10個(gè)RNA分子。文章指出，這個(gè)便攜裝置是監(jiān)控MERS-CoV傳播，尋找其動(dòng)物宿主的理想方法。[參考文獻(xiàn)]
RPA檢測埃博拉等十種致命威脅
檢測傳染性疾病的綜合panel，有助于資源匱乏地區(qū)進(jìn)行實(shí)地分子診斷，對生物防御工作也有很大的幫助。
《Journal of Clinical Microbiology》雜志去年四月的一項(xiàng)研究開發(fā)了一個(gè)RPA檢測panel，對土拉弗朗西斯氏菌（Francisella tularensis）、鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）、炭疽芽孢桿菌（Bacillus anthracis）、天花病毒進(jìn)行RPA分析，對裂谷熱病毒（Rift Valley fever virus）、埃博拉病毒、Sudan病毒和馬爾堡病毒進(jìn)行RT-RPA分析。研究顯示，這些RPA和RT-RPA的分析靈敏度大多在16-21個(gè)分子之間（與實(shí)時(shí)PCR相當(dāng)），42°C下只需運(yùn)行6-10分鐘，而且不存在交叉反應(yīng)。[參考文獻(xiàn)]
RPA檢測HIV
在HIV診治中，即時(shí)檢測是非常重要的，對嬰兒來說更是如此。有案例顯示，HIV感染后立刻進(jìn)行治療就能控制住患者體內(nèi)的病毒，讓它們無法進(jìn)行復(fù)制。舉例來說，生來就攜帶HIV的密西西比嬰兒，在出生后立即得到了治療。后來這個(gè)孩子停藥了兩年多，病毒復(fù)制依然得到了控制。
目前嬰兒HIV診斷的金標(biāo)方法是DNA PCR，但許多地區(qū)并不具備這樣的條件。在這種條件下，RPA技術(shù)正好可以大展身手。（四篇論文介紹了RPA在HIV檢測中的應(yīng)用）[詳細(xì)]
RPA在癌癥研究中的應(yīng)用
去年六月，新加坡A*STAR的研究團(tuán)隊(duì)在Lab on a Chip雜志上，發(fā)表了一種能夠快速檢測癌癥單點(diǎn)突變的新技術(shù)，等溫固相擴(kuò)增/檢測（ISAD）。這是一種無需標(biāo)記的實(shí)時(shí)檢測技術(shù)，將基于硅基微環(huán)（silicon microring）的固相擴(kuò)增與等溫重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）結(jié)合在一起。
去年十月，Talanta雜志上也發(fā)表了一項(xiàng)用到RPA技術(shù)的癌癥研究。該研究在超靈敏生物條碼分析（BBC）、適配體（aptamer）和RPA的基礎(chǔ)上，開發(fā)了一個(gè)檢測細(xì)胞色素C（Cyto-c）的新生物條碼分析法（ABC）。細(xì)胞色素C是細(xì)胞死亡的重要標(biāo)志物。（點(diǎn)擊鏈接查看這兩項(xiàng)研究的詳細(xì)報(bào)道和文獻(xiàn)）[詳細(xì)]
RPA全攻略之疑難解答
核酸檢測革命：可替代PCR的犀利技術(shù)——RPA
說了這么多，你們肯定會(huì)有很多疑問，引物怎么設(shè)計(jì)？RPA反應(yīng)能實(shí)現(xiàn)多重化么?RPA反應(yīng)能對模板進(jìn)行定量么? RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么? RPA支持生物素或熒光標(biāo)記的寡核苷酸么?以下就為大家一一解答。
RPA的擴(kuò)增引物可以說是整個(gè)反應(yīng)的關(guān)鍵所在，那么怎樣才能設(shè)計(jì)好RPA引物呢？引物長度怎樣選擇？引物序列有什么要求？擴(kuò)增產(chǎn)物長度有何限制？篩選的主要流程？答案詳見《RPA：引物與探針的常見問題》一文。此外，在該文中你還可以找到以下問題的答案。
可以。RPA技術(shù)支持在同一個(gè)管中同時(shí)進(jìn)行多個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)。不過，多重化的引物組合需要精心設(shè)計(jì)，以便每個(gè)引物都能同樣有效的工作。需要注意的是，RPA反應(yīng)的引物總量(nmol)最好不要超標(biāo)太多。如果在一個(gè)反應(yīng)中使用兩個(gè)以上的擴(kuò)增引物，就應(yīng)該控制不同引物的量。另外，我們應(yīng)當(dāng)事先考慮好檢測多個(gè)擴(kuò)增事件的探針、設(shè)備以及熒光團(tuán)的兼容性。
可以。擴(kuò)增子達(dá)到可檢出水平的時(shí)間，依賴于反應(yīng)起始時(shí)的模板量。初始模板的拷貝越多，擴(kuò)增子就越快達(dá)到可檢出水平。不過，這種定量需要精心的實(shí)驗(yàn)安排，確保對照反應(yīng)是同時(shí)開始的。舉例來說，可以利用鎂離子的添加時(shí)間進(jìn)行控制。因?yàn)殒V離子一旦進(jìn)入體系，RPA反應(yīng)就會(huì)開始。
此外，較慢的擴(kuò)增過程有助于更精確的定量。我們可以通過調(diào)整反應(yīng)條件或引物設(shè)計(jì)來減慢RPA的反應(yīng)速度。
可以。這樣比較的是反應(yīng)開始時(shí)的熒光和反應(yīng)結(jié)束時(shí)的熒光，熒光增強(qiáng)意味著發(fā)生了擴(kuò)增。
支持。在RPA反應(yīng)中，連有生物素或熒光團(tuán)的引物與未修飾的引物表現(xiàn)差不多。據(jù)悉還沒有發(fā)現(xiàn)任何差異。
可以。插入性染料可以在RPA反應(yīng)中進(jìn)行定量和監(jiān)控。不過，這種染料可以結(jié)合任何雙鏈DNA，會(huì)生成來自引物的假陽性信號。由于RPA擴(kuò)增在常溫下進(jìn)行，這種噪音會(huì)比PCR嚴(yán)重一些。
需要。RPA反應(yīng)中的物質(zhì)會(huì)干擾瓊脂糖電泳，如果不進(jìn)行產(chǎn)物回收，跑出來的帶會(huì)出現(xiàn)拖尾。
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