戊巴比妥鈉和異氟烷對(duì)大鼠急性應(yīng)激反應(yīng)的影響（一）
研究背景：麻醉后處死動(dòng)物在應(yīng)激方面的研究是普遍的，但是麻醉對(duì)結(jié)果的影響研究不足。我們的目的是探究不同麻醉劑的影響，如在大鼠急性應(yīng)激反應(yīng)時(shí)腹腔注射戊巴比妥鈉或吸入異氟烷。
方法：將大鼠隨機(jī)分為電擊（FS）和非應(yīng)激對(duì)照組，進(jìn)一步設(shè)定處死程序：直接斬首，腹腔注射戊巴比妥鈉或吸入異氟烷后斬首。再設(shè)定一組對(duì)照組腹腔注射生理鹽水后斷頭處死。測(cè)定血漿皮質(zhì)酮（CORT），睪酮和雌二醇，下丘腦應(yīng)激相關(guān)分子表達(dá)的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素，血管加壓素和催產(chǎn)素，與額葉相關(guān)分子表達(dá)的NMDA受體NR2B亞單位，GABAA受體和神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體。
結(jié)果：直接斬首組和異氟烷電擊（FS）顯著增加血漿皮質(zhì)酮（CORT），而腹腔注射戊巴比妥鈉注射后，這種應(yīng)激反未出現(xiàn)。非應(yīng)激對(duì)照組動(dòng)物，無論是注射生理鹽水還是戊巴比妥鈉都引起的血漿皮質(zhì)酮（CORT）顯著增加。各組間性激素水平和大腦中的相關(guān)分子mRNA的表達(dá)差異顯著。
結(jié)論：混合注射麻醉導(dǎo)致動(dòng)物應(yīng)激反應(yīng)，妨礙了血漿皮質(zhì)酮（CORT）水平，但影響血漿性激素水平和大腦mRNA的表達(dá)。異氟烷吸入應(yīng)激反應(yīng)影響較少，而且從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理的角度來看，也是最理想的。
1.簡(jiǎn)介
應(yīng)激反應(yīng)與情感性精神障礙病因?qū)W的關(guān)系[ 1 ]促進(jìn)了動(dòng)物模型應(yīng)激反應(yīng)的研究。壓力調(diào)節(jié)系統(tǒng)如下丘腦-垂體-腎上
腺（HPA）軸活動(dòng)已在不同的應(yīng)激活動(dòng)下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）活性研究是由促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）驅(qū)動(dòng)的物質(zhì)主要來自下丘腦室旁核（PVN）的下丘腦。HPA軸的最終目標(biāo)的壓力荷爾蒙激素，這主要是在大鼠皮質(zhì)酮（CORT）。我們和其他組發(fā)現(xiàn)性激素如睪酮（T）、雌二醇（E2）和神經(jīng)肽，如精氨酸加壓素（AVP）和催產(chǎn)素（OXT），在壓力反應(yīng)[
2 ]起重要調(diào)節(jié)作用。
處死動(dòng)物的方式來研究可能的混淆作用引起了我們的關(guān)注。相關(guān)的生物學(xué)研究處死動(dòng)物一般有兩種方法：直接斷頭或給藥后麻醉斷頭。斷頭可能是一個(gè)潛在的額外的壓力，這也取決于研究者的經(jīng)驗(yàn)，會(huì)影響研究結(jié)果[
3 ]。無意識(shí)的麻醉藥似乎減少了額外的壓力[ 4
]。然而，一些藥物，如苯巴比妥，也會(huì)引起額外的應(yīng)激反應(yīng)，表現(xiàn)為增加血漿CORT水平[5,6]。此外，麻醉劑影響興奮性受體抑制大腦的活動(dòng)，包括N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體NR2B亞單位與神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體（nnachr），通過抑制受體刺激如GABAA受體（GABAAR）[
7
]。到目前為止是否經(jīng)常使用麻醉劑如腹腔注射（ip）戊巴比妥鈉或異氟烷吸入可能影響大鼠腦mRNA表達(dá)與在急性應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的分子，也不清楚腹腔注射戊巴比妥鈉如何引起動(dòng)物的附加應(yīng)激。
因此我們分析了經(jīng)驗(yàn)豐富的研究員用不同方式處死動(dòng)物的影響，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉和吸入異氟烷后電擊（FS）和不刺激對(duì)照組比較，比較內(nèi)容包括血漿CORT，T和E2水平，下丘腦CRH
mRNA水平，AVP和OXT，與額葉NMDA-NR2B、 GABAAR、 mRNA和nnAChR的表達(dá)水平。
2.實(shí)驗(yàn)方法
2.1 倫理陳述
所有動(dòng)物使用和實(shí)驗(yàn)均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用和保護(hù)指南(National Research Council, 1996, USA)，經(jīng)中國(guó)國(guó)家委員會(huì)浙江分會(huì)批準(zhǔn)。盡最大努力來減少動(dòng)物的痛苦，并盡可能少用動(dòng)物（更多細(xì)節(jié)見補(bǔ)充材料1）。
2.2 電擊大鼠
雄性SD大鼠（體重300-330g），飼養(yǎng)在25-27℃房間，12h明暗交替，自由攝食飲水。給予一周時(shí)間適應(yīng)環(huán)境。擬定0.5mA電刺激5s，然后間隔25min。動(dòng)物居住條件和衛(wèi)生細(xì)節(jié)連同F(xiàn)S協(xié)議見輔助材料1.將大鼠隨機(jī)分為7組：1）對(duì)照或2）FS通過直接斷頭處死大鼠（分別為黃連解毒湯，F(xiàn)SD）；3）控制或4）腹腔注射3.5%戊巴比妥鈉（3ml/kg）5分鐘后FS大鼠斷頭處死（分別為和FSP）；5）對(duì)照或6）4%異氟醚在吸氧后1–2分鐘FS大鼠斷頭處死（綜合技術(shù)研究所或FSI組）；7）額外的對(duì)照組腹腔注射生理鹽水（3毫升/公斤）5分鐘后斷頭處死（CTR）。每組7只或8只大鼠。由相同的研究人員，電擊（FS）30分鐘內(nèi)處死動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)在每日15:00-16:00之間。采血、離心、收集血漿。迅速取出大鼠大腦、下丘腦和額葉進(jìn)行解剖。根據(jù)Paxinos和Watson的圖集[
10 ]下丘腦解剖位置是前囟點(diǎn)1.7mm。
所有的樣品都是立即凍結(jié)并存儲(chǔ)在?80°C直到進(jìn)行檢測(cè)。所有程序均符合當(dāng)?shù)貏?dòng)物保護(hù)委員會(huì)的有關(guān)規(guī)定和法律。
2.3 血漿激素水平測(cè)定
采用酶聯(lián)免疫法測(cè)定血漿CORT水平(RE52211,
IBL Corporation,
Germany)。變異(CV)的內(nèi)和間變異系數(shù)分別為3.38%和10.50%。用放射免疫分析法檢測(cè)血漿T水平(IM1087,
Immunotech Corporation,
USA)，一個(gè)內(nèi)和批間CV分別為2.6%和11.9%。通過酶聯(lián)免疫試劑盒測(cè)定血漿E2水平(ADI-900-174,
Enzolifesciences Corporation, USA)，一個(gè)內(nèi)和跨3.9%和11.37%的CV，分別。
2.4 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）在下丘腦和額葉的mRNA表達(dá)分析
對(duì)下丘腦CRH，AVP
mRNA與額葉NR2B，GABAAR和nnachr表達(dá)水平的檢測(cè)方法是光電導(dǎo)繼電器Q-PCR?？傊?
RNA用Trizol提取劑和基因與PrimeScript RT試劑盒合成。Q-PCR采用Bio-Rad cfx96觸摸熒光PCR儀進(jìn)行比[ 11
]。所有的程序都是按照制造商的指示進(jìn)行的。引物對(duì)CRH，AVP，OXT，NR2B，GABAAR-受體，nnachr和β肌動(dòng)蛋白mRNA設(shè)計(jì)與程序Primer
Premier 5。作為管家基因（見輔助材料2）
2.5 統(tǒng)計(jì)
當(dāng)數(shù)據(jù)被發(fā)現(xiàn)是不是正態(tài)分布，采用非參數(shù)測(cè)試。多組比較，第一–沃利斯試驗(yàn)采用Kruskal，如果有顯著性差異，組間比較進(jìn)一步進(jìn)行–Mann Whitney U檢驗(yàn)。P＜0.05被認(rèn)為是重要的。
