間接免疫熒光法的操作步驟介紹
1、細(xì)胞準(zhǔn)備與固定
?。?）單層生長細(xì)胞：取對數(shù)生長細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。將細(xì)胞接種到預(yù)先放置幾張6×22mm蓋玻片的培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中，置二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)1-3天，待細(xì)胞接近長成單層，取出蓋玻片，進(jìn)入PBS（0.01 mol/L,pH7.4）洗2次，然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，選擇適當(dāng)固定劑固定細(xì)胞。常用固定劑有：95％乙醇（固定時(shí)間10-30min），丙酮（5－10min）等。
（2) 懸浮生長細(xì)胞：取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm，5min）2次，或用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片，把細(xì)胞片浸入95％乙醇或丙酮中固定。
2、將已經(jīng)固定的細(xì)胞玻片放入蓋片染色缸，用PBS振洗5min，取出吹干。
3、滴加適當(dāng)稀釋的特異性抗體，置于濕盒內(nèi)，37度保溫30－60min或度冰箱過夜。
4、PBS振洗3次，每次5min，吹干。
5、滴加適當(dāng)稀釋的熒光素標(biāo)記抗體，置于濕盒內(nèi)，37度保溫30－60min。
6、PBS振洗2次，每次5min，然后用蒸餾水振洗1次。
7、50％緩沖甘油封片。
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