葉綠素a的分光光度法測(cè)定方法介紹
根據(jù)所用色素萃取液的不同，葉綠素a的分光光度法測(cè)定可分為丙酮法、甲醇法和乙醇法等；根據(jù)比色所用的波長(zhǎng)分為三色法和單色法，目前國(guó)際上普遍使用 Lorenzen單色法。 Lorenzen單色法主要是丙酮法和乙醇法，我國(guó)多年來一直沿用丙酮法。近年來，國(guó)際上從萃取效果和安全保健等方面考慮已經(jīng)逐漸改用乙醇法。
（1）丙酮法? 該方法適合于藻類繁殖得比較多的水樣和表面附著的藻類。
①基本原理。將一定量的水樣用玻璃纖維濾紙過濾，收集植物性浮游生物，用90％的丙酮溶液提取，并將提取物分離。
葉綠素a在波長(zhǎng)方面的最大吸收峰位于663nm，在一定濃度范圍內(nèi)，其吸光度值A(chǔ)與濃度c符合 Lambert-beer定律，可根據(jù)濃度吸光度之間的線性關(guān)系，計(jì)算葉綠素a的濃度。
②測(cè)試方法
a.以離心或過濾濃縮水樣，在抽濾器上裝好乙酸纖維薄膜。倒入定量體積的水樣進(jìn)行抽濾，水樣抽完后，繼續(xù)抽1~2min，以減少濾膜上的水分。
b.取出帶有浮游植物的濾膜，在冰箱內(nèi)低溫干燥6~8h后放入組織研磨器，加入少量碳酸鎂粉末及2~3mL90％丙酮，充分研磨，提取葉綠素a。用離心機(jī)（3000~4000r/min）分離10min，將上清液倒入5mL容量瓶中。
c.再用2~3mL90％丙酮繼續(xù)研磨提取，離心分離10min后倒入容量瓶中，重復(fù)1~2次，定容至5mL，搖勻。
d.取上清液于1mm比色皿中，以90％丙酮溶液為參照，分別讀取波長(zhǎng)750nm、663nm、645nm和630nm處的吸光度。同時(shí)以90％丙酮作空白對(duì)吸光度進(jìn)行校正。
③計(jì)算。葉綠素a的含量按如下公式計(jì)算:
（2）乙醇法過濾一定體積（V）的水樣（根據(jù)樣品中葉綠素含量決定），將濾膜向內(nèi)對(duì)折，放入5mL的離心管，保存在-20℃的冰箱中至少一晝夜。
取250mL玻璃三角瓶裝適量（約12mL）90％乙醇在控溫水浴鍋中預(yù)熱，水浴溫度80~85℃，取出樣品，立即加入4mL左右熱乙醇，水浴2min。再將樣品放入室溫下避光處萃取4~6h，最長(zhǎng)不超過12h。萃取結(jié)束后用25mm玻璃纖維濾膜過濾萃取液，并定容至10mL（V1）。
以90％乙醇為參比液進(jìn)行比色測(cè)定，分別測(cè)定波長(zhǎng)665nm和750nm處的吸光度D665和D750，然后在樣品比色皿中加入1mol/L的鹽酸化，加蓋搖勻，1min后重新測(cè)定前面兩個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度A665和A750，然后按下式進(jìn)行計(jì)算:
葉綠素a（mg/m3）=27.9V1×［（D665-D750）-（A665-A750）］/V
