血紅素的提取測定方法
提取原理
血紅蛋白在pH低于3.0時，血紅素與珠蛋白的結(jié)合最為疏松，此時加入有機溶劑丙酮，使珠蛋白變性凝固，血紅素則溶于丙酮中，在丙酮中加入適量的鞣酸或乙酸鈉，可得到較純的血紅素結(jié)晶，然后用乙醇一乙醚洗滌，可得到精制血紅素。血紅素在波長385處有最大吸收，可直接進行比色測定。?
試劑器材
1、試劑0.5%～1%檸檬酸三鈉；生理鹽水；95%乙醇；氯仿；0.15%亞硫酸氫鈉；丙酮；0.1 mol/L NaOH；1 mol/L鹽酸，血紅素標(biāo)準(zhǔn)品。
2、器材離心機；真空濃縮裝置；真空干燥機；分光光度計；新鮮豬血。
操作步驟
1、血紅素制備與純化
（1）新鮮豬血抗凝新鮮豬血，加入0.5%～1%檸檬酸三鈉溶液（V/V=10 : 1），攪拌均勻，得新鮮抗凝豬血。
（2）分離紅細胞取抗凝豬血10mL于離心管中，以3000r/min離心15min，傾出上清液（血漿），收集紅細胞，用0.9% NaCl洗滌2次。洗滌方法為：用適量生理鹽水懸浮紅細胞，攪拌均勻，離心，收集紅細胞沉淀，測定紅細胞體積（mL）。
（3）溶血加入相當(dāng)于紅細胞體積1倍的去離子水、0.25倍95%乙醇，攪拌30min，紅細胞吸水脹裂，血紅蛋白釋放出來。
（4）分離血紅蛋 白溶血后加人紅細胞體積0.15倍的氯仿，攪拌15min，離心，得到含血紅蛋白的沉淀物。
（5）分離血紅素 上述沉淀物中加入相等于紅細胞體積的0.15%亞硫酸氫鈉溶液，使其溶解，然后加入紅細胞體積4倍的丙酮，攪拌均勻，用0.1 mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH為3，使珠蛋白與血紅素充分分離（抽提時間為10 min以上），然后4000r/min離心10 min，棄沉淀，上清液即為血紅素丙酮溶液。
（6）血紅素純化 血紅素丙酮溶液采用真空濃縮并回收丙酮，濃縮物用0.1 mol/L NaOH溶解，3 000 r/min離心10 min，收集上清液。用0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH至4～5，沉淀血紅素，收集沉淀，用水洗沉淀至中性，50℃真空干燥至恒重，得血紅素。測定血紅素制品的重量（mg）。
2、血紅素測定
以0.1 mol/L NaOH分別溶解血紅素標(biāo)準(zhǔn)品和提取得到的血紅素制品，調(diào)整至適宜濃度，于385nm處測定吸光度，計算樣品中血紅素提取率及純度。
