帶您了解基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展
在生物多樣性急劇減少和物種消失的時(shí)代，有時(shí)被稱為“第六次大滅絕”或“全新世滅絕”，人們對(duì)開發(fā)有效的生物多樣性研究和監(jiān)測(cè)工具提出了很高的要求。迄今為止，世界各地的分類學(xué)家已經(jīng)描述了超過(guò)170萬(wàn)個(gè)物種。然而，這只是地球上預(yù)計(jì)存在的數(shù)百萬(wàn)生物的一小部分。當(dāng)試圖使用傳統(tǒng)的基于形態(tài)學(xué)的方法對(duì)所有物種進(jìn)行分類時(shí)，生物多樣性的絕對(duì)規(guī)模是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。據(jù)估計(jì)，僅描述500萬(wàn)種動(dòng)物物種的成本就可能高達(dá)2500億美元，需要6個(gè)世紀(jì)才能完成。
基于形態(tài)的分類學(xué)充滿了局限性，例如難以描繪形態(tài)上隱蔽的物種以及合格的分類學(xué)家數(shù)量的減少。這些限制產(chǎn)生了對(duì)更多創(chuàng)新分類法方法的需求。2003年，Paul Hebert和他的同事展示了采用基于基因組的方法進(jìn)行分類鑒定的方法。這種方法，被稱為“DNA條形碼”，是為了利用大多數(shù)真核生物中存在的短而保守的基因區(qū)域，提供快速準(zhǔn)確的生物鑒定而開發(fā)的。從那時(shí)起，DNA條形碼已成為生物有機(jī)體快速鑒定的一種既定方法。
今天，第一代桑格測(cè)序被廣泛認(rèn)為是DNA條形碼項(xiàng)目的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”。當(dāng)測(cè)序少于800個(gè)樣本時(shí)，它仍然是一種具有成本效益和準(zhǔn)確的方法。然而，近年來(lái)，測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速。高通量，下一代測(cè)序(NGS)技術(shù)，如Illumina或Ion Torrent，使用戶能夠在單個(gè)測(cè)序?qū)嶒?yàn)中多重處理數(shù)百個(gè)樣品，從而降低了成本，同時(shí)產(chǎn)生高度準(zhǔn)確的測(cè)序數(shù)據(jù)。當(dāng)將大量擴(kuò)增子(數(shù)千個(gè)樣本)合并到一次運(yùn)行中時(shí)，NGS的成本效益變得更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，盡管管理所有樣本和擴(kuò)增子對(duì)于下游分析可能變得非常困難。然而，NGS測(cè)序技術(shù)的局限性在于它們只能對(duì)大約100-600 bp的短DNA片段進(jìn)行測(cè)序。這比大多數(shù)首選的DNA條形碼(如CO1 (650 bp))要小，盡管最近的一項(xiàng)研究指出，長(zhǎng)產(chǎn)品(主要基于引物選擇和Sanger測(cè)序限制，而不是嚴(yán)格的測(cè)試)不再需要準(zhǔn)確性。最近，高通量第三代測(cè)序(TGS)平臺(tái)已經(jīng)發(fā)布，使研究人員能夠?qū)ΩL(zhǎng)的reads進(jìn)行測(cè)序，克服了NGS方法的局限性，同時(shí)保留了其優(yōu)勢(shì)，即對(duì)數(shù)百個(gè)樣本進(jìn)行多路復(fù)用，并為同一樣本獲得更多數(shù)據(jù)點(diǎn)。領(lǐng)先的TGS技術(shù)由太平洋生物科學(xué)公司(PacBio)和牛津納米孔技術(shù)公司(ONT)提供。
PacBio Sequel系列測(cè)序儀(Sequel I, II和IIe)使用單分子實(shí)時(shí)(SMRT)測(cè)序來(lái)生成高精度的長(zhǎng)讀序列。在SMRT測(cè)序中，發(fā)夾接頭連接到雙鏈DNA模板上，形成一組封閉的環(huán)狀模板，稱為SMRTbell庫(kù)。測(cè)序引物被退火到SMRTbell文庫(kù)，以促進(jìn)DNA聚合酶的結(jié)合，DNA聚合酶作為測(cè)序細(xì)胞底部的錨點(diǎn)，并標(biāo)記出測(cè)序的初始位點(diǎn)。該循環(huán)模板被反復(fù)測(cè)序以產(chǎn)生子reads，然后在循環(huán)共識(shí)測(cè)序(CCS)模式下使用，以產(chǎn)生精度大于99.9%的HiFi reads。
ONT技術(shù)依賴于嵌入在導(dǎo)電膜中的蛋白質(zhì)納米孔。當(dāng)單個(gè)DNA鏈通過(guò)孔時(shí)，它們引起離子電流的變化，然后用于實(shí)時(shí)表征每個(gè)核苷酸堿基。該技術(shù)有多種配置的測(cè)序流式細(xì)胞和化學(xué)試劑，從可擴(kuò)展的測(cè)序儀(例如Flongle, MinION流式細(xì)胞的廉價(jià)低容量替代品)到最高通量的PromethION流式細(xì)胞。目前，ONT使用新的Q20+化學(xué)和改進(jìn)的堿基調(diào)用軟件，擁有99%的模態(tài)原始讀取精度。
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