關(guān)于單克隆抗體的制備過(guò)程介紹
1.免疫動(dòng)物
免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過(guò)程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過(guò)血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。
2.細(xì)胞融合
采用二氧化碳?xì)怏w處死小鼠，無(wú)菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。
3.選擇性培養(yǎng)
選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的小鼠骨髓瘤細(xì)胞中DNA的從頭合成途徑會(huì)被阻止；未融合的骨髓瘤細(xì)胞又因缺乏次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT)，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA；這樣未融合小鼠骨髓瘤細(xì)胞的兩個(gè)DNA合成途徑都被阻止，骨髓瘤細(xì)胞DNA不能復(fù)制而死亡。 未融合的B淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外長(zhǎng)期存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從B淋巴細(xì)胞獲得了次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤-磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，可以通過(guò)補(bǔ)救途徑合成DNA，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無(wú)限增殖的特性，因此，雜交瘤細(xì)胞能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。
4.雜交瘤陽(yáng)性克隆的篩選與克隆化
在HAT培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過(guò)全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。
5.單克隆抗體的大量制備
單克隆抗體的大量制備主要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。
(1)體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約1-2周，可見(jiàn)小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。
(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過(guò)程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的生產(chǎn)量。
