RiboPrinter? 在肉毒梭菌鑒定和分子分型中的應用（二）
肉毒梭菌的Ribotyping鑒定及分子分型
?? 正因為肉毒梭菌的種內菌株的多樣性及其16S序列的高度保守性使得生化鑒定和16S測序鑒定等傳統(tǒng)技術對肉毒梭菌的鑒定存在諸多難點，所以研究者們不遺余力應用更多分子生物學技術以縮短肉毒梭菌的鑒定時間，簡化鑒定流程，增加鑒定結果的準確性和重現(xiàn)性。
??? Ribotyping（核糖體分型）是首個用于細菌鑒定和分型的分子指紋技術，無需依賴PCR技術，因此可避免非特異擴增問題，具有較高的保真性。其是在RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）和Southern ?Blot印跡基礎上發(fā)展起來的一種鑒定和分型方法，它將細菌的全基因組DNA用限制性內切酶消化，經電泳分離和Southern ?Blot轉印后，用放射性標記的rRNA操縱子探針雜交，根據帶型和帶數的多態(tài)性對細菌進行分子分型，同時因圖譜本身具備系統(tǒng)分類學的意義，因此可將圖譜與標準菌株數據庫的指紋模式（Ribo ?Pattern）進行比對，實現(xiàn)鑒定和分子分型的同步完成。
??? 該方法的優(yōu)點之一是廣譜性、通用性和特異性兼顧。由于核糖體編碼基因有較高的保守性，各種限制性酶切位點在細菌基因組內也廣泛分布，因此可用一種通用的探針和酶切方案對多種不同的微生物進行檢測，實現(xiàn)廣譜分析，特別適合未知病原菌的篩查和溯源，也滿足大規(guī)模檢測及食物中毒應急檢測的需求。用戶也可為某一特定種屬的細菌進行酶切方案和探針的探索及優(yōu)化，選用單一酶切或混和酶切的條件，及更為特異的探針，滿足更高特異性和分型力的需求，建立個性化的菌株指紋圖譜數據庫，見Grimont（1986）。
??? 該方法的另一大優(yōu)點是分型力較好。由于核糖體是細菌體內重要的蛋白質合成“工廠”，細菌通常具有多個核糖體編碼基因以滿足新陳代謝需要。通過Ribotyping，可獲得足夠數量不同分子大小的指紋條帶（一般為5~15條），具備較高的分型率和良好的重復性，分型圖譜穩(wěn)定性高、條帶多，見Anne（1991）。
??? Schalch等（1997）曾采用Ribotyping技術對10個食物中毒暴發(fā)事件中收集而來的34株產氣莢膜梭菌（Clostridium ?perfringens）進行了分型，得到了12種指紋模式（Ribotype），且從原因食品中和病人糞便樣本中分離得到的菌株的指紋模式高度吻合。
??? Hielm等（1999）首次采用Ribotyping技術對68株肉毒梭菌和5種相關的梭菌屬菌種進行了鑒定和分型，以考察該技術對引發(fā)中毒的肉毒梭菌的鑒定和分型能力。他們先后試驗了13種限制性內切酶，最終選擇以EcoR ?I和Hind ?III的酶切方案進行鑒定和分型。這兩種酶切方案及Ribotyping技術均顯示出了良好的鑒定和分型效果，可以顯著的區(qū)分蛋白分解型和非蛋白分解型的肉毒梭菌菌株，并被推薦為肉毒梭菌種屬鑒定的優(yōu)選方法。
??? 他們隨后用GelCompar軟件對兩種酶切方案得到的指紋圖譜進行了分型力分析以及UPGMA分析。結果顯示（見表四、圖二和圖三），EcoR ?I酶切獲得的Ribotyping指紋圖譜分型效果最好，分型指數（Discriminatory Index）高達0.982；Hind ?III酶切的分型能力也相當，分型指數為0.954。聚類分析的結果顯示，各菌株間的Dice相似系數為35±13%（中值±標準差）。這些結果都表明Ribotyping技術非常適合用于肉毒梭菌的鑒定和分子分型。
??? Hielm等還認為，對于肉毒梭菌，Ribotyping的分型能力與PFGE（脈沖場凝膠電泳）相當，且其圖譜具備PFGE所缺乏的細菌分類學意義，因此可用于肉毒梭菌的鑒定，而PFGE圖譜則因其隨機酶切的性質，無法用于鑒定。另一方面，隨著自動化的Ribotyping技術（杜邦RiboPrinter? ?System）的問世，大大簡化了鑒定和分型流程，相比繁瑣和對操作技術要求較高的PFGE技術具有顯著的優(yōu)勢。 表四：Ribotyping技術用于肉毒梭菌及其他梭菌屬菌株的分型能力分析
?? 圖二：肉毒梭菌EcoR I酶切的Ribotyping指紋圖譜的聚類分析
? ?? 圖三：肉毒梭菌Hind III酶切的Ribotyping指紋圖譜的聚類分析
??? 自動化的Ribotyping技術已經在病原微生物的風險分析和關鍵點控制（HACCP）體系、GMP體系、食品和藥品安全質控和質保、常規(guī)檢測、環(huán)境監(jiān)測、法規(guī)制定和基礎研究等領域引起了廣泛的關注并得到了長足的應用。
??? 隨著美國杜邦公司的RiboPrinter?系統(tǒng)的問世，Ribotyping技術實現(xiàn)了全自動化和標準化（見圖四）。因其出眾的性能、簡單的操作，RiboPrinter?系統(tǒng)已經成為世界眾多微生物學、分子生物學實驗室開展微生物鑒定和分子分型的首選設備，具備如下特點： 1.高通量，檢測速度快，鑒定加分子分型8小時內同步完成 2.結果準確，重復性和重現(xiàn)性好 3.廣譜的鑒定和分型能力，未知菌株可直接上機，無需預檢 4.通用試劑盒適用已知和未知細菌的鑒定和分型，及大規(guī)模篩查和應急檢測需求 5.開放平臺可滿足更高特異性檢測和個性化研究需求 6.支持種屬特異試劑盒和多酶切方案滿足更高分型力需求或建立菌株數據庫 7.操作簡單，自動化程度高，標準化流程內設，結果自動判讀，非經驗豐富人員也只需簡單培訓即可使用，節(jié)省不必要的用地和設備，人員8.培訓更簡單，成本更低 9.標準數據庫容量為8528個基因模式，包括1741個種和297個屬，標準菌株均來源ATCC（美國模式培養(yǎng)物研究所）、JCM（日本微生物菌種保藏中心）和DSMZ（德國微生物菌種保藏中心）。涵蓋環(huán)境菌（如葡萄球菌、微球菌、芽孢桿菌、梭菌屬等）；致腐菌（芽孢桿菌、假單胞菌、明串珠菌、梭菌屬等）；致病菌（腸出血性大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、弧菌、彎曲桿菌、阪崎腸桿菌等）；益生菌（乳酸桿菌、雙歧桿菌、乳球菌、嗜熱鏈球菌等）等多種類型
??? 圖四：杜邦RiboPrinter??System全自動微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)及流程
??? Bruce等（1995 & 1996）和Webster等（1994）曾證明在沙門氏菌和單增李斯特氏菌菌株分型技術方面，RiboPrinter?系統(tǒng)比傳統(tǒng)技術更為有效。 Wiedmann等（1996）曾成功用RiboPrinter?系統(tǒng)追溯到產品和環(huán)境中單增李斯特氏菌的污染，在動物源性病原菌疾病暴發(fā)的控制方面起到了積極作用。無獨有偶，Bruce等（1996）也成功用RiboPrinter?系統(tǒng)追溯到了食品加工廠環(huán)境中的金黃色葡萄球菌污染。 在Hielm等人的研究基礎上，Skinner等（2000）采用RiboPrinter?系統(tǒng)對30株肉毒梭菌和1株生孢梭菌的鑒定和分型能力進行了進一步的研究，獲得了成功。 他們開展該工作的原因之一，是因為Hielm等（1998）曾報道，采用PFGE對非蛋白分解型肉毒梭菌進行分型比較困難，很難獲得高質量的指紋圖譜。而且在分析B、E、F三型非蛋白分解型肉毒梭菌時，菌株DNA的降解成了一個非常困擾的問題。而此前，Samore等（1996）已經報道了，在33株難辨梭菌（Clostridium ?difficile）的分型工作中，PFGE對其中的23株都沒有成功分型，推測的原因也是菌株DNA的意外降解。 這31株各型的肉毒梭菌（見表五）均來自于美國食品藥品監(jiān)督管理局和罐頭食品企業(yè)，被接種于改良的厭氧卵黃瓊脂培養(yǎng)基上，在35℃下培養(yǎng)24h。用3mL緩沖液（2 mM Tris + 20 mM EDTA）淋洗平板及用滅菌接種針刮擦平板表面以獲得營養(yǎng)細胞，制成30μL每管的細胞混懸液，直接用于RiboPrinter?系統(tǒng)分析，經系統(tǒng)自動的加熱滅活、裂解、標準EcoR I酶切及后續(xù)分析等流程，獲得了較為理想的結果。
??? 表五：Skinner等用于分析的肉毒梭菌菌株表
??? 31株菌的分型結果如表六和圖五所示。Skinner等定義菌株相似度>93%的圖譜被歸為一個Ribogroup，故31株菌可被分成15個Ribogroup，并顯示了較高的重現(xiàn)性。其中23株蛋白分解型菌株（含A型和B型），5株非蛋白分解型菌株（B型）和2株E型菌株及1株生孢梭菌均得到了高分辨的分型。 表六：31株肉毒梭菌和產氣莢膜梭菌菌株經EcoR I酶切的Ribogroups模式列表
??? 圖五：30株肉毒梭菌經EcoR I酶切獲得15組Ribogroup圖譜
??? Skinner等隨即對菌株的來源和菌株的分組進行了綜合分析，證實了RiboPrinter?系統(tǒng)在菌株溯源方面的應用價值，見表七。 表七：部分肉毒梭菌菌株的追溯和圖譜分析
Ribogroup | 菌株 | 來源與圖譜分析 |
128-1 | CAM3-A,?CAM5-B | 來源于同一個雞肉蔬菜湯罐頭加工廠，來自于同一個生產批次的兩個罐頭樣本，分型結果在同一個Ribogroup |
137-3 | OS3-A,?4896-A | 均從1983年美國伊利諾伊州肉毒梭菌食物中毒事件中收集而來，其中4896-A來自病人的糞便，OS3-A來自于最終確認的原因食品——炒洋蔥，這兩株菌不僅被分在了一個Ribogroup中，且指紋圖譜相似度高達99% |
121-7 | Mush2-B,?Mush3-B | 均來自于1975年同一批次生產的鮮蘑菇，分型結果在同一個Ribogroup |
121-7 | 383-B,?642-B | 來源于1972-1973年生產的兩個批次鮮蘑菇樣本，分型結果在同一個Ribogroup |
137-8 | C.?sporogenes?PA?3679 | 該生孢梭菌的圖譜與A型肉毒梭菌的相似，從細菌分類學上很容易得到解釋，因為其與組I肉毒梭菌具有相似的培養(yǎng)和生化特征，唯一的區(qū)別是不會產BoNTs |
??? 從表七中可以看出，來源相近的肉毒梭菌菌株最終被追溯到同一個Ribogroup組別（如128-1, 137-3, 121-7,），而生化性質與肉毒梭菌接近的生孢梭菌則被分為了一個新的Ribogroup組別（如137-8），體現(xiàn)了RiboPrinter?系統(tǒng)較好的菌株追溯能力，及干擾菌株的排他能力，這在食物中毒病原體追溯、原因食品追溯、流行病學調查、院內感染、生產環(huán)境監(jiān)測和污染源追溯等領域有十分重要的應用價值。 圖六：29株肉毒梭菌經EcoR I酶切獲得的9組Ribogroup圖譜
???? Kennett等（2006）也采用RiboPrinter?系統(tǒng)及EcoR ?I酶切方案，對梭菌屬的7種，共計49株可引發(fā)食源性疾病的梭菌菌株進行了鑒定和分型，包括：耐氧梭菌（Clostridium ?? aerotolerans），拜氏梭菌（Clostridium beirjerinckii），腐敗梭菌（Clostridium ?putrificum），肉毒梭菌，酪酸梭菌，產氣莢膜梭菌和生孢梭菌。Kennett等同時設計了EcoR ?V酶切方案消化17株肉毒梭菌，以考察不同酶切方案對鑒定和分型效果的改善作用。結果證實RiboPrinter?系統(tǒng)可以較好地鑒定和分型這些梭菌屬的菌株，還可通過調整限制性酶切方案來分型不同表型和產毒型的菌株，可選的限制性內切酶除了EcoR I和EcoR V之外，還可選Cla I，Hind III，Spe I，Rsa I等，部分圖譜可見圖六。
??? 綜上所述，杜邦RiboPrinter??System在肉毒梭菌及其他梭菌屬細菌的鑒定和分子分型領域有著廣闊的應用前景和突出的使用價值。依托杜邦的行業(yè)領先技術，該鑒定分型產品的技術路線可有效地保障政府檢測機構、第三方檢測實驗室、研究院所和食品、藥品企業(yè)快速、準確、標準化地鑒定和分型肉毒梭菌，建立菌株信息庫，有效追溯污染菌株，從而預警和控制潛在的肉毒梭菌暴發(fā)和致命食源性疾病發(fā)生的風險。
