流式細(xì)胞術(shù)在免疫學(xué)中的應(yīng)用
流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是二十世紀(jì)70年代發(fā)展起來(lái)的，是一項(xiàng)集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測(cè)量技術(shù)、計(jì)算機(jī)技術(shù)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型技術(shù)，能夠?qū)μ幵诳焖僦本€流動(dòng)狀態(tài)中的細(xì)胞或微球進(jìn)行多參數(shù)的、快速的定量分析和分選，且能保持細(xì)胞及細(xì)胞器或微粒的結(jié)構(gòu)及功能不被破壞。通過(guò)熒光探針的協(xié)助，它不但可以定量檢測(cè)細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的各種細(xì)胞成份，而且可以研究細(xì)胞的各種功能狀態(tài)，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等，廣泛應(yīng)用于科研和臨床。本文僅對(duì)FCM在免疫學(xué)中的應(yīng)用做一簡(jiǎn)要綜述。
1、流式細(xì)胞術(shù)原理
流式細(xì)胞儀的基本工作原理是采用激光作為激發(fā)光源，利用熒光染料與單克隆抗體結(jié)合的標(biāo)記技術(shù)，通過(guò)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)流動(dòng)的單個(gè)細(xì)胞或微粒的多個(gè)參數(shù)信號(hào)進(jìn)行數(shù)據(jù)資料處理，從而對(duì)目的細(xì)胞或微粒進(jìn)行詳細(xì)的分析。FCM常用的熒光染料有FITC（異硫氰酸熒光素）、PE（藻紅蛋白）、PI（碘化丙啶）等，常用的標(biāo)記方法為直接免疫熒光染色和間接免疫熒光染色，采用的是抗原抗體特異性結(jié)合的原理。直接免疫熒光法多用于對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志的染色分析，選用單克隆熒光抗體，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體，特異性高，缺點(diǎn)是敏感性偏低。間接免疫熒光法是選用特異性單抗（一抗）與待測(cè)細(xì)胞結(jié)合后，再用熒光二抗（針對(duì)一抗的特異性抗體）進(jìn)行標(biāo)記染色，形成抗原-抗體-熒光抗體復(fù)合物后上機(jī)檢測(cè)分析。此法應(yīng)用廣泛，最適宜檢測(cè)一些新的未知抗原，進(jìn)行一些研究分析。這種方法只要標(biāo)記幾類種屬特異性不相同的二抗即可。由于流式細(xì)胞儀及軟件系統(tǒng)的飛速發(fā)展，為了獲取雙參數(shù)或多參數(shù)數(shù)據(jù)資料，需要進(jìn)行熒光抗體的組合標(biāo)記，常采用二色、三色、四色甚至更多標(biāo)記。
2、FCM在免疫學(xué)中的應(yīng)用
隨著單克隆抗體技術(shù)、熒光色素化學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，正像免疫學(xué)作為一種不斷發(fā)展的學(xué)科和技術(shù)手段延伸到生物、醫(yī)學(xué)及其他領(lǐng)域一樣，流式細(xì)胞術(shù)也以它的快速、靈活和定量的特點(diǎn)，廣泛地被應(yīng)用于免疫學(xué)理論研究和臨床實(shí)踐的各方面，包括淋巴細(xì)胞及其亞群測(cè)定、淋巴細(xì)胞功能檢測(cè)、白血病免疫分型、移植免疫和自身免疫性疾病相關(guān)HLA抗原分析中的應(yīng)用等。
2.1 淋巴細(xì)胞及其亞群測(cè)定
FCM通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面抗原，可以將不同的淋巴細(xì)胞亞群區(qū)分開(kāi)，計(jì)算它們之間的比例，甚至可以絕對(duì)計(jì)數(shù)。經(jīng)常測(cè)定的淋巴細(xì)胞亞群包括T淋巴細(xì)胞（CD3＋），T輔助細(xì)胞（CD3＋、CD4＋、CD8-），T抑制細(xì)胞（CD3＋、CD4-、CD8＋），B淋巴細(xì)胞（CD19＋或CD20＋），NK細(xì)胞（CD3-、CD16＋、CD56＋）等。通過(guò)檢測(cè)淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志，可了解在不同情況下機(jī)體的免疫功能狀態(tài)，輔助診斷疾病，指導(dǎo)臨床治療。Fumihito Yoshii等[1]對(duì)18例吉蘭-巴雷綜合征（GBS）患者發(fā)病初期血液進(jìn)行檢測(cè)則發(fā)現(xiàn)，CD3＋、CD4＋和CD4＋、CD45、RA＋T細(xì)胞較健康對(duì)照組增加，經(jīng)過(guò)血漿置換治療后，這種淋巴細(xì)胞亞群的改變趨于正常。正常狀態(tài)下CD4＋/CD8＋一般為2/1，但是當(dāng)患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病時(shí)，使用FCM檢測(cè)二者的比值就會(huì)升高[2]；當(dāng)患有艾滋病或者其它腫瘤時(shí)，使用FCM檢測(cè)二者的比值就會(huì)下降[3]。淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)可用于疾病的診斷和治療中，如艾滋病患者的血液中CD4＋T細(xì)胞＜200個(gè)/μl，而僅有HIV感染而未發(fā)病者，則CD4＋T細(xì)胞＞200個(gè)/μl，淋巴細(xì)胞亞群的絕對(duì)計(jì)數(shù)是實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)發(fā)展的趨勢(shì)。FCM與傳統(tǒng)的免疫熒光抗體染色后再用熒光顯微鏡觀察，或用細(xì)胞免疫組化方法染色后用普通顯微鏡觀察100-200個(gè)細(xì)胞相比，其結(jié)果更為真實(shí)和客觀，更具有指導(dǎo)意義。
2.2 淋巴細(xì)胞功能分析
淋巴細(xì)胞表面抗原的檢測(cè)不能完全了解淋巴細(xì)胞的功能，需要對(duì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子或體外培養(yǎng)細(xì)胞后進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。檢測(cè)細(xì)胞因子的方法有酶連免疫斑點(diǎn)法、有限稀釋分析法、RT-PCR法、原位免疫組化法、ElISA法等。每種方法都有自己的特點(diǎn)，但相比較，F(xiàn)CM更有優(yōu)勢(shì)。FCM不僅可檢測(cè)細(xì)胞群中單個(gè)細(xì)胞分泌的特有或共表達(dá)的不同因子，確定產(chǎn)生細(xì)胞因子的陽(yáng)性細(xì)胞的百分率，而且可同時(shí)確定陽(yáng)性細(xì)胞的表型，是一種可以在單細(xì)胞水平研究細(xì)胞因子的有效方法[4]。FCM可在同一細(xì)胞內(nèi)同時(shí)檢測(cè)兩種不同的細(xì)胞因子，也可用多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)對(duì)胞內(nèi)多種細(xì)胞因子進(jìn)行測(cè)定。目前，在臨床上利用FCM檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子（Intracellular Cytokine，ICK）來(lái)反映淋巴細(xì)胞的免疫功能，尤其是T細(xì)胞的功能。例如HIV選擇性地作用于宿主的CD4＋T細(xì)胞，使之大量耗竭，用FCM檢測(cè)CD4＋T細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子可間接反映CD4＋T細(xì)胞的免疫功能。傳統(tǒng)的形態(tài)法、氚標(biāo)胸腺嘧啶核苷（3H-TDR）摻入法、MTT比色法等均不能反映不同T細(xì)胞亞群的增殖狀態(tài)，而用活細(xì)胞染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯（CFSE）標(biāo)記淋巴細(xì)胞，結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)可有效檢測(cè)出不同T細(xì)胞亞群對(duì)不同刺激劑的增殖反應(yīng)以及增殖動(dòng)力學(xué)變化[5]。范艷瑩等[6]用CFSE標(biāo)記結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)研究人外周血NK細(xì)胞分裂、增殖和殺傷功能。金齊力等[7]用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人γδT細(xì)胞對(duì)MTB感染THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，并觀察Il-15對(duì)人γδT細(xì)胞殺傷MTB感染THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的影響。
2.3 白血病免疫分型
白血病長(zhǎng)期以來(lái)主要通過(guò)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞組織化學(xué)進(jìn)行診斷，在很大程度上依賴于檢驗(yàn)者的經(jīng)驗(yàn)，主觀性明顯。FCM免疫分型是從造血細(xì)胞克隆進(jìn)化過(guò)程中分化抗原表達(dá)的角度來(lái)認(rèn)識(shí)白血病細(xì)胞克隆的特點(diǎn)及分化階段，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞漿或細(xì)胞核的抗原表達(dá)。各種血細(xì)胞系統(tǒng)都有其獨(dú)特的標(biāo)志，當(dāng)形態(tài)學(xué)檢查難以區(qū)別時(shí)，免疫分型參數(shù)對(duì)各種白血病的診斷和鑒別診斷有決定作用。例如干細(xì)胞表達(dá)CD34，髓系表達(dá)CD13及MPO，B細(xì)胞系表達(dá)CD10、CD19、CD20等，T細(xì)胞系表達(dá)CD2、CD3、CD5、CD7。采用CD45/側(cè)散射（SSC）雙參數(shù)散點(diǎn)圖設(shè)門方法進(jìn)行三色或四色流式細(xì)胞術(shù)，可以很好地鑒別各系列，為白血病的診斷、治療及預(yù)后判斷提供了重要的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
2.4 HLA-B27的檢測(cè)
強(qiáng)直性脊柱炎（Ankylosing Spon-Dylitis，AS）是一種自身免疫性疾病，而HLA-B27（人類白細(xì)胞抗原B27）是具有高度遺傳多態(tài)性的人類白細(xì)胞抗原B座位上的一個(gè)等位基因。1973年Brewerton等[8]報(bào)道HLA-B27與AS密切相關(guān)，Brown[9]報(bào)道AS患者HLA-B27陽(yáng)性率高達(dá)94%，而正常人群中僅為9%。用FCM檢測(cè)HLA-B27抗原，將單克隆抗體與外周血共孵育，裂解紅細(xì)胞，洗滌固定后上機(jī)檢測(cè)。文獻(xiàn)報(bào)道，該法的假陰性和假陽(yáng)性率小于5%，是一種適用于臨床的、可信賴的檢測(cè)方法[10]。由于此法無(wú)需分離細(xì)胞，比傳統(tǒng)的微量細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)節(jié)約時(shí)間，應(yīng)用特異性單抗檢測(cè)抗原，可以排除交叉反應(yīng)，提高檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性。
2.5 移植免疫
目前移植免疫中FCM主要用于交叉配型（Flow Cytometry Cross-Matching，F(xiàn)CXM）和群體反應(yīng)性抗體（Panel Reactive Antibody，PRA）檢測(cè)。1983年Garovoy[11]首次提出了FCXM技術(shù)，經(jīng)不斷完善，已被廣泛應(yīng)用。研究表明，術(shù)前FCXM陽(yáng)性的心臟移植患者，術(shù)后急性排斥反應(yīng)發(fā)生率較對(duì)照組高，并且發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)率明顯高于FCXM陰性患者[12]；也有報(bào)道6例術(shù)后FCXM陽(yáng)性的肝移植患者均在1個(gè)月以內(nèi)發(fā)生了急性排斥反應(yīng)，而FCXM陰性患者中僅17.4%的患者發(fā)生了急性排斥反應(yīng)[13]。由此可見(jiàn)FCXM在器官移植中有著重要的應(yīng)用價(jià)值。PRA檢測(cè)的最新進(jìn)展是免疫磁珠流式細(xì)胞儀分析方法（Flow Pratmbeads）。該方法是集智能化和自動(dòng)化為一體的檢測(cè)技術(shù)，靈敏度高，特異性高，傳統(tǒng)的補(bǔ)體依賴性淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)（CDC）方法敏感性低、費(fèi)時(shí)且人為誤判多，移植后易發(fā)生超急性排斥反應(yīng)，而ElISA方法很難指明PRA抗體的抗原特異性。Flow Pratm Beads不僅能檢測(cè)出PRA含量，而且能指定PRA的種類（抗T細(xì)胞抗體，抗B細(xì)胞抗體、抗單核細(xì)胞抗體甚至抗血管內(nèi)皮細(xì)胞抗體），可以檢測(cè)多種類型抗體（IGG、IGM、IGA等），這給臨床醫(yī)生提供更具體更有價(jià)值的信息，以便更恰當(dāng)?shù)剡M(jìn)行供者選擇。
3、新進(jìn)展及應(yīng)用前景
流式細(xì)胞儀不斷改進(jìn)、測(cè)定方法迅速發(fā)展以及高質(zhì)量試劑的研制，為提高FCM檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和分析能力提供了保障。長(zhǎng)期以來(lái)FCM的應(yīng)用一直陷于對(duì)細(xì)胞或顆粒的分析，隨著膠乳顆粒在流式細(xì)胞分析中的應(yīng)用，“液相芯片”技術(shù)的出現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了流式細(xì)胞儀對(duì)可溶性物質(zhì)的分析，實(shí)現(xiàn)了樣本分析時(shí)的低樣本量、多參數(shù)檢測(cè)。另外，流式微球陣列（CBA）技術(shù)也屬于液相芯片技術(shù)。這些技術(shù)將FCM的應(yīng)用領(lǐng)域進(jìn)一步擴(kuò)展，發(fā)展了一種新的技術(shù)平臺(tái)?？梢灶A(yù)見(jiàn)，在未來(lái)免疫學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床檢測(cè)領(lǐng)域，流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用范圍會(huì)進(jìn)一步擴(kuò)大，應(yīng)用深度會(huì)進(jìn)一步加強(qiáng)。雖然，這種方法還具有一些自身的缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴、對(duì)操作人員要求高等，但是這些缺點(diǎn)一定會(huì)隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步逐步被克服。
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綜述
