實(shí)時熒光定量 PCR 所用熒光探針及功能介紹
應(yīng)用于實(shí)時定量 PCR 檢測體系中的熒光探針主要有兩種:一種是 TaqMan 探針,一種是分子信標(biāo)探針。
Tyagi 和 Krammer(1996)首次建立了分子信標(biāo)探針,在同一寡核苷酸探針的5'端標(biāo)記熒光素、3'端標(biāo)記淬滅劑(DABCYL)分子信標(biāo)探針能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),探針的嚕撲環(huán)(LOOP)與目的 DNA 堿基互補(bǔ),嚕撲環(huán)兩側(cè)為與目的 DNA 無關(guān)的堿基互補(bǔ)的臂。
無目的 DNA 時,探針形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),熒光素靠近淬滅劑,熒光素接受的能量通過共振能量轉(zhuǎn)移至淬滅劑,DABCYL 吸收能量后以熱量形式消失,結(jié)果不產(chǎn)生熒光。當(dāng)探針遇到目的 DNA 分子時,形成一個比兩臂雜交更長也更穩(wěn)定的雜交,探針自發(fā)進(jìn)行構(gòu)型變化,使兩臂分開,熒光素和淬滅劑隨之分開,此時在紫外照射下,熒光素產(chǎn)生熒光。
影響分子信標(biāo)探針構(gòu)型變化的參數(shù)主要有:臂長、臂序列 GC 含量、撲環(huán)長度和溶液鹽濃度,尤其是二價陽離子如 Mg2+對兩臂形成的雜交莖有較強(qiáng)的穩(wěn)定作用,在 Mg2+存在條件下,4～12個核苷酸可形成穩(wěn)定的雜交莖。嚕撲環(huán)長度至少應(yīng)是臂長的2倍,才能保證探針與目標(biāo) DNA 雜交及熒光素與淬滅劑分開。TaqMan 探針是一段5'端標(biāo)記報告熒光基團(tuán),3'端標(biāo)記淬滅熒光基團(tuán)的寡核苷酸。報告熒光基團(tuán)如 FAM 共價結(jié)合到寡核苷酸的5'端。TET,VIC,JOE 及 HEX 也常用作報告熒光基團(tuán)。所有這些報告熒光基通常都由位于3'端的 TAMRA 所淬滅。當(dāng)探針完整時,由于報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)在位置上很接近,導(dǎo)致其報告熒光的發(fā)射主要由于 Forster 型能量傳遞而受到抑制。
在 PCR 過程中,上游和下游引物與目標(biāo) DNA 的特定序列結(jié)合,TaqMan 探針則與 PCR 產(chǎn)物相結(jié)合。Taq DNA 聚合酶的5'—3'外切活性將 TaqMan 探針?biāo)?。而報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)由于探針?biāo)舛嗷シ珠_,導(dǎo)致報告熒光信號的增加。TaqMan探針的3端則經(jīng)過化學(xué)修飾,以防止其在 PCR 過程中被延伸。探針與產(chǎn)物的結(jié)合發(fā)生于PCR 的每一循環(huán),但并不影響 PCR 產(chǎn)物的指數(shù)積累。
報告熒光基團(tuán)與淬滅熒光基團(tuán)的分離導(dǎo)致報告熒光信號的增加,而熒光信號的增加可被系統(tǒng)檢測到,它是模板被 PCR 擴(kuò)增的直接標(biāo)志。
引物和探針都必須與模板結(jié)合(雜交),才能實(shí)現(xiàn) PCR 擴(kuò)增和探針的水解;與探針特異結(jié)合的 DNA 模板得到擴(kuò)增時才能產(chǎn)生熒光信號。基于這兩點(diǎn)要求,即使發(fā)生非特異性擴(kuò)增,也不會影響檢測結(jié)果。
熒光定量檢測的主要影響因素在于所用探針的純度以及鎂離子濃度,二者在很大程度上決定了檢測結(jié)果的真實(shí)性和可靠性。
探針的純度直接影響探針熒光本底的高低。任何標(biāo)記報告基團(tuán)而無淬滅基團(tuán)的分子都是污染源,未淬滅的報告熒光使探針的熒光本底增高,導(dǎo)致難以辨認(rèn)由于探針裂解而產(chǎn)生的報告熒光的變化。
同時由于探針標(biāo)記不完全,即只標(biāo)記了報告熒光素或只標(biāo)記了淬滅熒光素或二者均未標(biāo)記上,這樣,即使熒光探針與擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合,也不能檢測到熒光信號的增長,很容易造成假陰性。另外,鎂離子濃度的高低也直接影響了檢測的靈敏度。
