DNA定量法比較——紫外—可見吸收光譜和熒光光譜優(yōu)勢(shì)比較
通常情況下，對(duì)定量DNA應(yīng)用熒光或紫外-可見光譜。兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，重要的是應(yīng)考慮在整個(gè)分析中，包括上、下游工藝的方法。
對(duì)分子生物學(xué)家而言，DNA定量是一種重要而常規(guī)的技術(shù)。量化數(shù)據(jù)本身很少被當(dāng)作實(shí)驗(yàn)的最終結(jié)果，更常見的是將其作為生物源提取物和下游使用、分析之間的橋梁。定量是重要的，但是，由于生物系統(tǒng)始終存在的變化，因此導(dǎo)致提取的DNA存在差異：不僅在數(shù)量上有差異，而且也與從原始來(lái)源及提取方法本身的污染水平有關(guān)。錯(cuò)誤的濃度測(cè)量，容易導(dǎo)致下游應(yīng)用過(guò)度或不足；或者因污染物的存在，抑制下游的分析。
DNA定量最常用的兩種方法是紫外-可見吸收光譜法和熒光光譜法。對(duì)于純化的DNA，采用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定樣本在260nm的吸光度（A260）是應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)為快速、易于實(shí)現(xiàn)。熒光法則需要使用熒光探針，如Hoechst或PicoGreen熒光染料，當(dāng)這些染料與DNA結(jié)合時(shí)，可以發(fā)出熒光。因?yàn)閮煞N方法各具優(yōu)點(diǎn)，因此在兩者之間進(jìn)行選擇，應(yīng)考慮工作流中的上游和下游步驟，再?zèng)Q定使用哪種技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。
圖1. 使用納米微滴2000分光光度計(jì)進(jìn)行微量測(cè)定。A）低濃度樣品，儀器自動(dòng)選擇一個(gè)長(zhǎng)光程；B）高濃度樣品，儀器會(huì)自動(dòng)選擇最佳的短光程精度
濃度范圍
熒光光譜和紫外光譜之間最重要的區(qū)別是可用濃度范圍。以比色皿為基礎(chǔ)的紫外-可見吸收光譜分光光度計(jì)，通常能夠在大約0.4~75ng/μl范圍內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，而可變光程微量?jī)x器如賽默飛世爾科技公司的微量紫外分光光度計(jì)NanoDrop 2000，不受固定光程比色皿的使用限制，可測(cè)量范圍達(dá)到15000ng/μl。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的樣品，通常都在這些濃度范圍之內(nèi)。然而在某些情況下使用A260（如腫瘤活檢等醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用），則會(huì)因?yàn)闈舛忍突驑颖炯兌炔粔颍瑹o(wú)法進(jìn)行精確的定量。
在這種情況下，可使用熒光光譜法測(cè)定，如應(yīng)用賽默飛的微量熒光分光光度計(jì)NanoDrop 3300，可量化0.05~2000pg/μl之間的DNA樣本。選擇分光光度計(jì)時(shí)，最重要的考慮因素也許是儀器的動(dòng)態(tài)范圍（如圖1所示）?？赡苄枰褂貌煌獬痰谋壬蠡蚺浼?，進(jìn)行多次測(cè)量，或分析多個(gè)稀釋樣品。這樣不僅浪費(fèi)時(shí)間，也會(huì)對(duì)樣品造成浪費(fèi)。除非樣本濃度是在配件的精確范圍之內(nèi)，否則無(wú)法提供準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。
污染物檢測(cè)
使用熒光分光儀，排除了污染物的檢測(cè)；而使用分光光度計(jì)，通過(guò)比較260nm、280nm和230nm處的吸光度，更有利于DNA樣品的純度評(píng)估。如A260/A280和A260/A230的比值，建立起了良好的“確定樣品純度的方法”，前者表示蛋白質(zhì)的污染水平，后者表示潛在的碳水化合物污染或提取過(guò)程中攜帶的化學(xué)物質(zhì)。
圖2. 純化的、未污染的DNA光譜（A），相同的DNA樣本含有胍（B）和（C）苯酚。通?？煞謩e在230nm和260nm處觀察到光譜中的波谷和峰值波長(zhǎng)的變化
此外，對(duì)光譜形狀的檢查，尤其是波峰和波谷的波長(zhǎng)可以進(jìn)一步提供有關(guān)污染物的信息（如圖2所示）。一些污染物表現(xiàn)出特定的光譜特征，如苯酚，在270nm處有很強(qiáng)的吸收峰。通常在260nm處出現(xiàn)的一個(gè)強(qiáng)的吸收峰，移位到接近270nm處的一個(gè)更高的波峰——如果出現(xiàn)此種情況，容易診斷酚污染。
特異性
所有核苷酸的光吸收峰都為260nm，因此分光光度計(jì)一般無(wú)法對(duì)雙鏈DNA，單鏈DNA，RNA和未結(jié)合的核苷酸進(jìn)行區(qū)分。為了精確地量化從生物樣品中提取的DNA，要求DNA不能包含其他的核酸，或必須使用熒光分光儀。許多市售的DNA提取試劑盒，對(duì)DNA是高度選擇性的，通常采用RNase酶去除RNA，并且通過(guò)適當(dāng)?shù)南礈斐ノ唇Y(jié)合的核苷酸。然而，一些DNA提取方法，特別是許多“自制”的方法，提取特異性較差，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)DNA和RNA的混合物，在這種情況下，使用一個(gè)特定的熒光探針，無(wú)需進(jìn)一步純化就可實(shí)現(xiàn)量化。
速度
由于應(yīng)用的技術(shù)有所不同，DNA定量的速度差異也很大。雖然許多儀器制造商強(qiáng)調(diào)一次只能進(jìn)行單一的測(cè)量，但這往往具有一定的誤導(dǎo)性。
考慮速度的同時(shí)，更應(yīng)該考慮整個(gè)過(guò)程，包括很多步驟，如儀器的預(yù)熱和軟件的編制、上樣、制備稀釋樣品、測(cè)量時(shí)間、樣品清除、洗滌，數(shù)據(jù)輸出和濃度計(jì)算等。傳統(tǒng)的分光光度計(jì)通常需要預(yù)熱期，使用比色皿、稀釋和手工計(jì)算濃度，需要花費(fèi)大量的時(shí)間。
圖3. NanoDrop 2000體積小巧，節(jié)省了實(shí)驗(yàn)室的寶貴空間
雖然后期研發(fā)的一些儀器不需要進(jìn)行預(yù)熱，為了最大限度的節(jié)省時(shí)間，需使用如納米微滴用工具。A260的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于，使用紫外可見分光光度計(jì)可以直接測(cè)量樣品。而應(yīng)用熒光試劑，在測(cè)量前必須準(zhǔn)備試劑，與樣品混合，隨后獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，實(shí)際上增加了完成DNA定量所需的時(shí)間。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
紫外可見光譜依賴于DNA的吸光度，可以直接進(jìn)行測(cè)量，而不需要準(zhǔn)備儀器或樣品。熒光分光光度計(jì)依賴于樣品所用的熒光，不同批次的熒光團(tuán)、設(shè)備、培養(yǎng)時(shí)間或溫度，都會(huì)帶來(lái)一定的差異。若采用標(biāo)準(zhǔn)曲線，則可以去除這些差異，因此在樣品定量前，必須要測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)曲線。
與標(biāo)準(zhǔn)曲線一樣，標(biāo)準(zhǔn)本身必須是可靠的，通常需準(zhǔn)備一系列稀釋液。若降低標(biāo)準(zhǔn)，或樣品以任何方式被污染，或稀釋系列不是精心準(zhǔn)備的，都將無(wú)法保證樣品量化結(jié)果的正確性。
小結(jié)
當(dāng)然，紫外-可見吸收光譜和熒光光譜法二者的優(yōu)點(diǎn)同時(shí)存在的情況還是有的，比如下一代測(cè)序方案需要采用這兩種技術(shù)去測(cè)量，以準(zhǔn)確地量化DNA的特異性，以及通過(guò)檢測(cè)樣品光譜、評(píng)估污染物的存在。然而，對(duì)許多用戶來(lái)說(shuō)，采用其中一種量化的技術(shù)就足夠了。刀御天元純度較高的樣品，紫外可見光譜法更為常用，主要是因?yàn)槠渌俣群鸵子眯?；如果樣品濃度很低或在樣品中檢測(cè)到RNA，就需要把額外的時(shí)間和精力用于熒光測(cè)量。
