單克隆抗體制備中兩次篩選的方法及原理
第一次篩選的原理與方法 細(xì)胞融合后 雜交瘤細(xì)胞的選擇性培養(yǎng)是第一次篩選的關(guān)鍵 普遍采用的HAT選擇培養(yǎng)液是在普通的動物細(xì)胞培養(yǎng)液中加入次黃嘌呤（H） 氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）其依據(jù)是細(xì)胞中的DNA合成有兩條途徑是生物合成途徑（D途徑）即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸 為DNA分子的合成提供原料 在此合成過程中 葉酸作為重要的輔酶參與這一過程 而HAT培養(yǎng)液中氨基酸喋呤是一種葉酸的拮抗物 可以阻斷DNA合成的D途徑 另一條途徑是應(yīng)急途徑或補(bǔ)救途徑（S途徑）它是利用次黃嘌呤一鳥嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應(yīng)的核苷酸 兩種酶缺一不可 因此 在HAT培養(yǎng)液中 未融合的效應(yīng)B細(xì)胞和兩個效應(yīng)B細(xì)胞融合的 D途徑 被氨基嘌呤阻斷 雖 S途徑 正常 但因缺乏在體外培養(yǎng)液中增殖的能力 一般10d左右會死亡 對于骨髓瘤細(xì)胞以及自身融合細(xì)胞而言 由于通常采用的骨髓瘤細(xì)胞是次黃嘌呤一嘌呤磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶缺陷型（HGPRT）細(xì)胞 因此自身沒有 S途徑 且 D途徑 又被氨基喋呤阻斷 所以在HAT培養(yǎng)液中也不能增殖而很快死亡 惟有骨髓瘤細(xì)胞與效應(yīng)B細(xì)胞相互融合形成的雜交瘤細(xì)胞 即具有效應(yīng)B細(xì)胞的 S途徑 又具有骨髓瘤細(xì)胞在體外培養(yǎng)液中長期增殖的特性 因此能在HAT培養(yǎng)液中選擇性存活下來 并不斷增殖
第二次篩選的原理和方法在實(shí)際免疫過程中 由于采用連續(xù)注射抗原的方法 且一種抗原決定簇刺激機(jī)體形成相對應(yīng)的一種效應(yīng)B淋巴細(xì)胞的特異性是不同的 經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選的雜交瘤細(xì)胞特異性也存在差異 所以必須從雜交瘤細(xì)胞群中篩選出能產(chǎn)生針對某一預(yù)定抗原決定簇的特異性雜交瘤細(xì)胞 通常采用有限稀釋克隆細(xì)胞的方法 將雜交瘤細(xì)胞多倍稀釋 接種在多孔的細(xì)胞培養(yǎng)板上 使每一孔含一個或幾個雜交瘤細(xì)胞（理論上30%的孔中細(xì)胞數(shù)為0時(shí) 才能保證有些孔中是單個細(xì)胞）再由這些單細(xì)胞克隆生長 最終選出分泌預(yù)定特異抗體的雜交細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng) 因此 單克隆抗體制備過程中 兩次篩選的原理和方法是不相同的
原理
B淋巴細(xì)胞在抗原的刺激下 能夠分化 增殖形成具有針對這種抗原分泌特異抗體的能力 B細(xì)胞的這種能力和量是有限的 不可能持續(xù)分化增殖下去 因此產(chǎn)生免疫球蛋白的能力也是極其微小的 將這種B細(xì)胞與非分泌型的骨髓瘤細(xì)胞融合形成雜交瘤細(xì)胞 再進(jìn)一步克隆化 這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞是即具有瘤的無限生長的能力 又具有產(chǎn)生特異性抗體的B淋巴細(xì)胞的能力 將這種克隆化的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)或注入小鼠體內(nèi)即可獲得大量的高效價(jià) 單一的特異性抗體 這種技術(shù)即稱為單克隆抗體技術(shù)
