Ames試驗(yàn)（沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)）方法及導(dǎo)則（一）
鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Ames試驗(yàn)，Salmonella Typhimurium / Reverse Mutation Assay）于 1975年建立并不斷發(fā)展完善，目前已被世界各國(guó)廣為采用，已經(jīng)成為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)室必需開展的重要實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。Ames實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)待分析物質(zhì)的致突變作用，該驗(yàn)靈敏、高效、檢測(cè)范圍廣。
Ames?試驗(yàn)原理
Ames 試驗(yàn)利用鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，該缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)；假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌誘導(dǎo)回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物。某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變， 故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的 S9混合液。北京匯智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司針對(duì)Ames試驗(yàn)開發(fā)Ames試劑盒， 本試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；試劑盒各成分均經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量檢測(cè)，無雜菌污染，菌株特性與活菌數(shù)目以及誘導(dǎo) S9 活性均符合 Ames 試驗(yàn)要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠、重現(xiàn)性高。Ames試劑盒應(yīng)用廣泛，可進(jìn)行食品與飲用水、化學(xué)品、洗滌劑、消毒劑、食品添加劑、藥物殘留、化妝品、容器與包裝材料等多個(gè)方面的遺傳毒理學(xué)檢測(cè)。
Ames試驗(yàn)導(dǎo)則
1 ?范圍
本規(guī)范確定了鼠傷寒沙門氏菌／回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的基本原則、要求和方法。
本規(guī)范適用于化妝品原料及其產(chǎn)品的基因突變檢測(cè)。
2 ?規(guī)范性引用文件
OECD ?Guidelines for Testing of Chemicals (No.471,Adopted:21,July 1997)。
3 ?定義
3.1??回復(fù)突變（Reverse mutation）
細(xì)菌在化學(xué)致突變物作用下由營(yíng)養(yǎng)缺陷型回變到原養(yǎng)型(prototroph)。
3.2??基因突變?（Gene mutation）
在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生變化。
3.3??堿基置換突變?（Base substitution mutation）
引起DNA鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。
堿基置換有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。
轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。
顛換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替。
3.4 ?移碼突變（?Frameshift mutation）
引起DNA鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。
3.5 ?鼠傷寒沙門氏菌/回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（?Salmonella typhimurium/reverse mutation assay）
利用一組鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型試驗(yàn)菌株測(cè)定引起沙門氏菌堿基置換或移碼突變的化學(xué)物質(zhì)所誘發(fā)的組氨酸缺陷型(his-)→原養(yǎng)型(his+)回復(fù)突變的試驗(yàn)方法。
3.6 ?S9
經(jīng)多氯聯(lián)苯(PCB混合物)或苯巴比妥鈉和β-萘黃酮結(jié)合誘導(dǎo)的大鼠制備肝勻漿，在9000g下離心10min后的肝勻漿上清液。
4 ?原理
鼠傷寒沙門氏組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株不能合成組氨酸，故在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上，僅少數(shù)自發(fā)回復(fù)突變的細(xì)菌生長(zhǎng)。假如有致突變物存在，則營(yíng)養(yǎng)缺陷型的細(xì)菌回復(fù)突變成原養(yǎng)型，因而能生長(zhǎng)形成菌落，據(jù)此判斷受試物是否為致突變物?？墒褂帽本﹨R智泰康醫(yī)藥技術(shù)有限公司研發(fā)生產(chǎn)的Ames試劑盒，試劑盒省去了培養(yǎng)基成分準(zhǔn)備、誘導(dǎo) S9 制備、菌株 鑒定、菌株培養(yǎng)等時(shí)間，可以直接使用，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。
某些致突變物需要代謝活化后才能引起回復(fù)突變，?故需加入經(jīng)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)的大鼠肝制備的S9混合液。
5??儀器和設(shè)備
培養(yǎng)箱、恒溫水浴、振蕩水浴搖床、壓力蒸汽消毒器、干熱烤箱、低溫冰箱(-80℃) 或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混勻振蕩器、勻漿器、菌落計(jì)數(shù)器、低溫高速離心機(jī)，玻璃器皿等。
6 ?培養(yǎng)基和試劑
6.1??0.5mmol/L組氨酸-0.5mmol/L生物素溶液
? 成分：?L-組氨酸(MW??155)? 78mg
????? D-生物素(MW??244) 122mg
????? 加蒸餾水至 1000mL
?????配制：將上述成分加熱，以溶解生物素，然后在0.068MPa下高壓滅菌20min。貯于4℃冰箱。
6.2??頂層瓊脂培養(yǎng)基
??成分： 瓊脂粉 1.2g
????? 氯化鈉 1.0g
????? 加蒸餾水至 200mL
??配制：上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。實(shí)驗(yàn)時(shí)，加入0.5mmol/L組氨酸—0.5mmol/L生物素溶液20mL。
6.3??Vogel-Bonner (V-B) 培養(yǎng)基E
??成分：枸椽酸(C6H8O7·H2O) 100g
???? 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 500g
???? 磷酸氫銨鈉(NaNH4HPO4·4H2O) 175g
???? 硫酸鎂(MgSO4·7H2O) 10g
???? 加蒸餾水至 1000mL
??配制：先將前三種成分加熱溶解后，再將溶解的硫酸鎂緩緩倒入容量瓶中，加蒸餾水至1000mL。于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
6.4 ?20%葡萄糖溶液
??成分：葡萄糖 200g
???? 加蒸餾水至 1000mL
??配制：加少量蒸餾水加溫溶解葡萄糖，再加蒸餾水至1000mL。于0.068MPa下高壓滅菌20min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
6.5 ?底層瓊脂培養(yǎng)基
??成分：瓊脂粉 7.5g ???
???? 蒸餾水 480mL ???
???? V-B培養(yǎng)基E 10mL ???
???? 20%葡萄糖溶液 10mL ???
配制：首先將前兩種成分于0.103MPa下高壓滅菌30min后，再加入后兩種成分，充分混勻倒底層平板。按每皿25mL制備平板，冷凝固化后倒置于37℃培養(yǎng)箱中24h，備用。
6.6??營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基
?????成分：牛肉膏 2.5g
??????? 胰 ?胨 5.0g
??????? 磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.0g
??????? 加蒸餾水至 500mL
?????配制：將上述成分混合后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
6.7??鹽溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)
??成分：氯化鉀(KCl) 61.5g
???? 氯化鎂(MgCl2·6H2O) 40.7g
???? 加蒸餾水至 500mL
??配制：在水中溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
6.8??0.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)
??成分：磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O) 2.965g
???? 磷酸氫二鈉(Na2HPO4·12H2O) 29.015g
???? 加蒸餾水至 500mL
??配制：溶解上述成分后，于0.103MPa下高壓滅菌30min。儲(chǔ)于4℃冰箱。
6.9??S9混合液
??成分 每毫升S9混合液
??肝S9 100ml
??鹽溶液 20ml
??滅菌蒸餾水 380ml
??0.2mol/L磷酸鹽緩沖液 500ml
??輔酶II(NADP) 4mmol
??6-磷酸葡萄糖(G-6-P) 5mmol
??配制：將輔酶II和6-磷酸葡萄糖置于滅菌三角瓶?jī)?nèi)稱重，然后按上述相反的次序加入各種成分，?使肝S9加到已有緩沖液的溶液中。該混合液必須臨用現(xiàn)配，并保存于冰水浴中。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，剩余S9混合液應(yīng)該丟棄。
