流式細胞術圖（1）
概述
流式圖有很多種，最常用的是流式直方圖和流式散點圖，還有流式等高線圖。流式直方圖只能顯示一個通道的信息，流式散點圖和流式等高線圖可以同時顯示2個通道的信息。
流式通道
散射光通道
散射光通道有兩個，包括FSC通道和SSC通道，一般所有的流式細胞儀均有這2個散射光通道；
FSC，即前向角散射，它的值代表細胞的大小。細胞體積越大，其FSC值就越大。所以可以利用細胞的FSC值初步比較細胞的大小，利用FSC值對細胞進行分群和分類。
SSC，即側向角散射，它的值代表細胞的顆粒度（granularity）。細胞越不規(guī)則，細胞表面的突起越多，細胞內能夠引起激光散射的細胞器或者顆粒性物質越多，其SSC值就越大。所以可以利用細胞的SSC值初步比較細胞的顆粒度，利用SSC值對細胞進行分群和分類。
一般在硏究細胞樣品時，首先關注的就是樣品中細胞的FSC-SSC散點圖，x軸代表FSC值，y軸代表SSC值，將細胞都顯示于該散點圖中，可以初步根據細胞的大小和顆粒度對細胞進行分群和分類。樣品細胞不需要標記任何熒光素偶聯(lián)抗體，直接上樣分析就可以得到樣品細胞的FSC值和SSC值，其值代表的是細胞的大小和顆粒度這兩個基本的物理特征，所以樣品的FSC-SSC散點圖又稱為樣品細胞的 “物理圖”。
熒光通道：
不同型號的流式細胞儀其熒光通道的多少差異較大，有的甚至沒有熒光通道。
熒光通道表示的不是細胞特有的物理特征，而是其化學特征。如需要檢測樣品中是否有細胞表達某一CD分子，則需要標記熒光素偶聯(lián)的該CD分子的抗體，表達有該CD分子的細胞就會結合熒光素偶聯(lián)抗該CD分子的抗體，表達有該CD分子的細胞就會結合熒光素偶聯(lián)抗體，其中的熒光素被相應的激光激發(fā)后產生熒光，該熒光信號通過光路系統(tǒng)被相應的熒光通道接收，就能得到該樣品中是否有細胞表達該CD分子，以及有多少比例的細胞表達該CD分子等信息。熒光通道接收到的信號越強，表示細胞上結合的熒光素越多，那么細胞表面表達的該CD分子就越多，因此可根據熒光信號的強弱判斷細胞表達該CD分子的相對數(shù)量?？傊?，熒光通道值反映接收到的熒光信號的強弱，從而反映細胞上結合的熒光素的量，進一步反映細胞上表達該CD分子的量，最后間接反映細胞表達某CD分子這一化學特征。
不同細胞群的FSC值和SSC值最多相差幾倍，而熒光信號強弱之間一般相差很大，陰性細胞與陽性細胞之間、強陽性與弱陽性之間有時可以相差幾十倍、幾百倍，甚至幾千倍，呈指數(shù)關系。所以，流式圖數(shù)軸上FSC值和SSC值以“一般數(shù)序形式”表示，而熒光通道值常以“對數(shù)形式”（logarithmic scale）表示，在識圖時需要注意數(shù)軸的表示形式。當然，并不是所有的熒光通道值都以“對數(shù)形式”表示，當熒光信號值相差不多時，也可以“一般數(shù)序形式”表示，如P染色檢測細胞內DNA含量以及Hoechst33342染色分析和分選側群干細胞時，均以“一般數(shù)序形式”表示。
流式直方圖
流式直方圖形成的原理與統(tǒng)計學中的直方圖相似，是在統(tǒng)計學直方圖的基礎上進一步發(fā)展而成的。流式直方圖的x軸表示一個通道的值，y軸表示細胞數(shù)量。
流式直方圖雖不是如此簡單，但是基本原理是相同的。流式直方圖是在此統(tǒng)計直方圖的基礎上，使統(tǒng)計區(qū)間不斷地縮小，縮小到甚至可以認為一個值就是一個統(tǒng)計區(qū)間，使統(tǒng)計的細胞數(shù)量不斷地增加，增加到以萬計，甚至以十萬計時，相鄰的小統(tǒng)計區(qū)間內的細胞數(shù)相差不多，這時的直方圖好像是由光滑的曲線所圍成的。其實，這只是直方圖統(tǒng)計的細胞數(shù)達到一定量時視覺上的一個假象，這個由光滑的曲線圍成的流式直方圖實際上是由無數(shù)個非常小的統(tǒng)計區(qū)間組成的。為了方便理解，可以認為x軸上的一個點就是一個統(tǒng)計區(qū)間，而曲線上該點對應的y軸值就是x軸代表的通道的熒光信號值對應的細胞數(shù)。這時，統(tǒng)計細胞群體比例時可以通過計算曲線下所圍的面積的比例來表示。
流式直方圖本質上就是統(tǒng)計直方圖，是累積顯示細胞量非常大而統(tǒng)計區(qū)間又非常小的統(tǒng)計直方圖。
流式散點圖
流式直方圖只能表示一個通道的信息，而流式散點圖能夠同時表示兩個通道的信息。流式散點圖也是采取坐標軸的方式，x軸表示一個通道的值，y軸表示另一個通道的值，圖中每一點代表一個細胞，該點所對應的橫坐標值就是該點所代表細胞的x軸通道的值，所對應的縱坐標值就是該點所代表細胞的y軸通道的值。
與流式直方圖相比，流式散點圖能夠同時表示兩個通道的值，能夠更加直觀地表示細胞的信息，所以流式散點圖更加直觀和常用。雖然，兩張流式直方圖也可以表示兩個通道的信息，但是兩張流式直方圖不能表示細胞這兩個通道值之間的相互關系，如不能直觀地表示其中一個通道值低的細胞其另一個通道值是高還是低，而在流式散點圖中卻可以非常直觀地發(fā)現(xiàn)細胞群體中這兩個通道值的相互高低關系，從而更易于細胞分群、分類，以及確定比例關系等。
下圖所示的是某正常人外周血白細胞FSC－SSC散點圖。FSC代表細胞的大小，SSC代表細胞的顆粒度，從圖中可以看出，根據細胞的大小和顆粒度，正常人外周血白細胞可以分為3群。進一步研究發(fā)現(xiàn)：小細胞、小顆粒度的紅色細胞群是淋巴細胞群，T細胞、B細胞和NK細胞都位于此淋巴細胞群；中細胞、中顆粒度的綠色細胞群是單核細胞群；大細胞、大顆粒度的黃色細胞群是中性粒細胞群。
一般在流式分析過程中，先利用FSC-SSC物理圖根據細胞的大小和顆粒度將細胞進行分群，然后根據目標細胞處于哪個群體，再將該群體細胞設門（set gate），進一步分析該群體中的目標細胞。
門（gate）是流式分析過程中一個較為重要的概念，流式分析時有時不希望所有的樣品細胞都顯示于流式圖中，而是希望只顯示感興趣的細胞，排除其他非相關細胞的干擾，使顯示的信息更加直觀，更具有針對性。例如，分析CD25+調節(jié)性T細胞占CD4+T細胞的比例時，樣品細胞是小鼠脾臟單個核細胞，此時可以根據CD4的表達情況，將CD4+T細胞設門顯示于一個新的流式圖中，則該流式圖只顯示所設門內的細胞，即只顯示CD4+T細胞，其他無關細胞不會被顯示。在相應散點圖中x軸代表CD4信息，y軸代表CD25信息，這樣就可以非常直觀地計算出調節(jié)性T細胞的比例。
流式等高線圖
流式等高線圖與流式散點圖相似，一張流式等高線圖也能同時顯示兩個通道的信息，所不同的是，它借助地理等高線圖的形式。地理等高線圖用封閉的環(huán)線代表海拔高度相同的地方，環(huán)線聚集越多，表示海拔高度變化越快，環(huán)線的中央區(qū)域表示海拔最高或者最低的區(qū)域。流式等高線圖借助地理等高線圖表示細胞的密集程度，流式等高線圖的環(huán)線代表的是細胞密度相同的區(qū)域，所以，環(huán)線聚集越多的地方表示此區(qū)域細胞密度變化越快，細胞最稀疏的地方還是用散點表示，環(huán)線的中央區(qū)域代表細胞聚集的中心。
流式等高線圖的意義和實際應用與流式散點圖較為相似，可以看作是流式散點圖的一個變體。相比之下，流式散點圖更為直觀，所以應用也更為廣泛。當然，流式等高線圖也有其自身的優(yōu)點，它較能直觀地體現(xiàn)細胞群的集中點，等密度環(huán)線的中央區(qū)域代表一個細胞群的集中點，一般代表一個細胞群，所以在某些情況下，流式等高線圖比流式散點圖更能直觀地體現(xiàn)細胞的分群。
