WB檢測(cè)中二抗的選擇方法
二抗選擇
二抗是用一抗免疫動(dòng)物制備的抗一抗的抗體，選擇范圍較窄，基本是商品化的，在不考慮二抗修飾類型的前提下，二抗的選擇需要遵循以下原則：二抗來源種屬、一抗來源種屬和抗原來源種屬互不相同。例如如果研究對(duì)象是人的蛋白X，選擇了鼠抗X一抗，則可選擇兔抗鼠二抗或者羊抗鼠二抗。
二抗選擇要考慮的問題有：
①對(duì)單抗類一抗，二抗需與一抗的類別或亞類相匹配（多抗類一抗主要是IgG類免疫球蛋白故相應(yīng)二抗就是抗IgG抗體，不作考慮）。
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一抗類別或亞類 |
二抗???????????????? |
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IgM?????????? |
抗IgM?????????????? |
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IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3??? |
抗IgG、抗IgG1、抗IgG2a、抗IgG2b、抗IgG3?????? |
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未知????????? |
抗IgG??????????????? |
②某些組織或細(xì)胞含有較多的Fc受體，如脾臟、淋巴細(xì)胞等，此時(shí)二抗需要選擇抗IgG F(ab’)2二抗，避免各種Ig保守結(jié)構(gòu)域?qū)е碌慕徊娣磻?yīng)。然而各種Ig仍具有保守的輕鏈結(jié)構(gòu)域，因此還是有一定程度的交叉反應(yīng)。
WB檢測(cè)之內(nèi)參抗體
Western Blot檢測(cè)方法不僅能檢測(cè)靶蛋白存在與否，還能比較不同條件下或者不同組織中靶蛋白的相對(duì)表達(dá)量，可作為蛋白表達(dá)水平最直接的證據(jù)。在WB實(shí)驗(yàn)中有眾多不確定因素影響靶蛋白表達(dá)水平的測(cè)定，如方法學(xué)本身性質(zhì)、操作誤差等。為準(zhǔn)確衡量靶蛋白表達(dá)水平，需要精確一致的上樣量，使用內(nèi)參的意義即是保證上樣量的一致。內(nèi)參即內(nèi)部參照（Internal Control），對(duì)哺乳動(dòng)物細(xì)胞一般指管家基因的表達(dá)蛋白(Housekeeping Proteins)。此類蛋白在各組織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定，可作為檢測(cè)蛋白表達(dá)水平變化的參照物。當(dāng)內(nèi)參條帶亮度基本一致時(shí)，基本可以確定上樣量是一致的，通常采用比較靶蛋白和內(nèi)參蛋白條帶亮度比值來進(jìn)行相對(duì)定量。
WB實(shí)驗(yàn)中涉及到的蛋白-抗體結(jié)合是一個(gè)復(fù)雜的活性生物大分子間的相互作用，眾多因素都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。例如時(shí)間、溫度、濃度、離子強(qiáng)度等，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)就需要有嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?duì)照方案，通過對(duì)照就容易判斷問題所在，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腤B實(shí)驗(yàn)中需要設(shè)立蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)、空白載體對(duì)照、未誘導(dǎo)對(duì)照、已知量標(biāo)準(zhǔn)物正對(duì)照和內(nèi)參。
內(nèi)參使用方法
1.標(biāo)記內(nèi)參：酶標(biāo)的內(nèi)參抗體可避免二抗結(jié)合總蛋白中某些免疫球蛋白產(chǎn)生的雜帶，使用時(shí)只需在二抗孵育時(shí)加入酶標(biāo)內(nèi)參抗體，按照正常操作即可。
2.普通內(nèi)參：當(dāng)靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差不大時(shí)，可先對(duì)靶蛋白進(jìn)行顯色檢測(cè)，然后用Strip緩沖液洗掉膜上抗體，重新對(duì)內(nèi)參蛋白進(jìn)行顯色檢測(cè)。當(dāng)靶蛋白分子量與所選內(nèi)參分子量相差較明顯時(shí)，可對(duì)轉(zhuǎn)膜預(yù)染，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量將膜剪為兩部分并分開進(jìn)行靶蛋白和內(nèi)參蛋白的顯色檢測(cè)。
內(nèi)參抗體選擇
常用的蛋白內(nèi)參有GAPDH和β-actin或β-tubulin，內(nèi)參的選擇原則是選擇與靶蛋白分子量相差5KD以上的內(nèi)參，對(duì)不同的樣本則需要根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行選擇。
1.根據(jù)物種選擇
哺乳動(dòng)物來源的組織或細(xì)胞樣本通常選擇β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3、Na+/K+-ATPase等。植物來源的樣本常選擇plant actin、Rubisco等。對(duì)于其他研究稀少的物種可參考報(bào)導(dǎo)的文獻(xiàn)進(jìn)行選擇。以GAPDH為例，抗GAPDH單抗（ABGENT，clone 6C5）能夠與非洲蟾蜍、猴、豬、羊、狗、貓、魚、蛙、雞、兔、小鼠、大鼠及人組織來源的GAPDH反應(yīng)，但不能與酵母GAPDH反應(yīng)。
2.根據(jù)組織類型選擇
以肌動(dòng)蛋白actin為例，肌動(dòng)蛋白actin在不同物種之間高度保守，且同一物種不同類型actin的序列相似性大于90%，使其很難獲得特異性較好的抗actin抗血清。但同一物種不同類型actin的N段序列相似性僅50~60%，故N端序列常被用來制備抗actin的抗體。脊椎動(dòng)物肌動(dòng)蛋白分為α、β和γ三種類型，α型分布于心肌、橫紋肌細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞中，γ型分布于平滑肌細(xì)胞和非肌細(xì)胞中，β型分布于非肌細(xì)胞中，共六種actin蛋白。不同廠商生產(chǎn)抗β-actin抗體過程中選擇的免疫區(qū)段在不同型actin之間的保守與否影響到抗體的組織特異性。選用β-actin N端的16個(gè)氨基酸序列制備的單多抗占大多數(shù)，這類抗體均不能檢測(cè)心肌和橫紋肌中的actin條帶。選用β-actin C端16個(gè)氨基酸序列制備的抗體則可以在肌肉細(xì)胞中檢測(cè)到actin的信號(hào)。
3.根據(jù)蛋白組分選擇
提取細(xì)胞蛋白組分過程中，胞漿蛋白通常是最先提取出來的。離心全細(xì)胞裂解液所得的上清含胞漿蛋白，而沉淀含胞核蛋白和胞膜蛋白，繼續(xù)加大裂解程度即可提取到胞核蛋白，最后才能提取到胞膜蛋白。通過特殊的方法還可以從胞漿蛋白中提取到線粒體蛋白、葉綠體蛋白等。針對(duì)不同的細(xì)胞組分需要選擇不同的內(nèi)參抗體。
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類目?? |
內(nèi)參??????? |
觀測(cè)分子量?? |
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細(xì)胞總蛋白 |
GAPDH?????? |
36 kDa???? |
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β-actin?????? |
42kDa????? |
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β-tubulin??????? |
55kDa????? |
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胞膜蛋白 |
Na+/K+-ATPase??? |
100kDa???? |
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Integrin??????? |
90-160kDa??? |
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胞漿蛋白 |
caveolin-1????? |
20-24kDa??? |
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Actin??????? |
42kDa???? |
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Tubulin?????? |
50kDa???? |
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線粒體蛋白 |
VDAC1?????? |
35-37kDa??? |
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COX IV?????? |
17kDa????? |
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胞核蛋白 |
Lamin A?????? |
65 kDa,70kDa? |
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Lamin B?????? |
66-70kDa??? |
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Histone H3????? |
18kDa???? |
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PCNA??????? |
36kDa???? |
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laminA/C?????? |
74kDa???? |
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Caveolin?????? |
20-24kDa??? |
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TATA binding protein? |
鼠源：33-36kDa 人源：37-43kDa |
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Pax-5??????? |
45kDa???? |
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Rb???????? |
110kDa???? |
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c-Jun??????? |
43 kDa,48kDa? |
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c-Fos??????? |
62kDa???? |
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nucleoporin p62?? |
61kDa???? |
在選擇細(xì)胞總蛋白內(nèi)參時(shí)，GAPDH、β-actin、tubulin三種內(nèi)參同時(shí)發(fā)生變化的情況很少。如出現(xiàn)這種情況，可用胞核內(nèi)參甚至線粒體內(nèi)參代替。另外，不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康膽?yīng)選擇不同的內(nèi)參，例如檢驗(yàn)質(zhì)核分離效果應(yīng)選擇胞漿蛋白內(nèi)參actin，抽提的核組分中檢測(cè)不到actin則表示質(zhì)核分離效果較好。
總之，內(nèi)參的選擇要根據(jù)實(shí)際情況而定，不僅要考慮到物種、組織、組分等因素，還需要考慮到實(shí)際的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。如實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中包括組織缺氧、糖尿病等因素變量，則不適宜選擇GAPDH作內(nèi)參，研究細(xì)胞增殖的相關(guān)實(shí)驗(yàn)中則不適宜選擇c-Jun作內(nèi)參，在凋亡實(shí)驗(yàn)中則要避免使用TBP、Lamin等。
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