高通量SNP分子分型技術(shù)(KASP技術(shù))經(jīng)驗(yàn)分享
重要的事情說(shuō)三遍，終于可以開始實(shí)驗(yàn)了,但在實(shí)驗(yàn)前或?qū)嶒?yàn)中乃在實(shí)驗(yàn)后,根據(jù)小編多年的經(jīng)驗(yàn),您可能會(huì)遇到以下問(wèn)題,不用擔(dān)心,待小編為您一一解答.
1.引物設(shè)計(jì)提交序列時(shí)的注意事項(xiàng)有哪些？
我們要求所提交的序列長(zhǎng)度至少為目標(biāo)位點(diǎn)上下游各50bp。請(qǐng)注意序列來(lái)源，盡量保證序列準(zhǔn)確，多態(tài)性位點(diǎn)BLAST結(jié)果證明為單拷貝也就是要特異。標(biāo)注出不確定的序列及引物設(shè)計(jì)時(shí)需要跳過(guò)的堿基和序列，目標(biāo)位點(diǎn)周圍其他多態(tài)性位點(diǎn)（最多可以有2個(gè)）用IUPAC碼標(biāo)注。
2. PCR反應(yīng)體系是怎樣的？
96孔板，10μL 體系，其中5μL DNA， 5μL mix, 0.14 μL引物。
384孔板，5μL體系，其中2.5μL DNA ， 2.5 μL mix, 0.07μL引物。
384 Array Tape, 1.6μL 體系，其中0.8 μL DNA, 0.8μL mix, 0.022μL 引物。
1536孔板，1ul 體系，其中1.5 μL DNA （烘干），1 μL mix, 0.014μL引物。
3. KASP技術(shù)對(duì)DNA有什么要求？?
建議最小的DNA濃度為2.5 ng / μL。根據(jù)基因組大小，所需的DNA的量為：待測(cè)樣品基因組/3000Mb*5ng。建議設(shè)置DNA濃度梯度實(shí)驗(yàn)，來(lái)確定最合適的DNA濃度。 KASP 對(duì)DNA純度的要求不高， 一般粗提的DNA即可滿足，但請(qǐng)盡量保證DNA濃度的一致性, 提取及溶解過(guò)程中盡量不要用到EDTA， 因?yàn)? EDTA會(huì)阻止KASP酶的作用。如有EDTA，建議將DNA稀釋一下，做一下濃度梯度實(shí)驗(yàn)或加MgCl2優(yōu)化。
4. 多個(gè)引物可以同時(shí)跑在同一塊板子上嗎？?
可以，但KASP技術(shù)要求每個(gè)引物至少跑22個(gè)樣品加兩個(gè)NTC，否則可能影響分群判讀，造成較大的誤差。
5. NTC信號(hào)值很高，怎么辦？?
NTC跑很高可能有三個(gè)原因，一是NTC被DNA樣品污染，二是循環(huán)數(shù)太多，引物 自身擴(kuò)增。建議多加幾個(gè)NTC，注意污染問(wèn)題，再看看。三是，引物設(shè)計(jì)問(wèn)題，擴(kuò)增產(chǎn)物中有引物二聚體存在， 建議重新設(shè)計(jì)引物。
6. 為什么需要recycling(加循環(huán)）, 什么時(shí)候需要加循環(huán)？
我們以36個(gè)循環(huán)作為標(biāo)準(zhǔn)的反應(yīng)程序,由于不同的引物擴(kuò)增速度及效率不同,部分引物在36個(gè)循環(huán)時(shí)并不能達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，導(dǎo)致熒光信號(hào)較低，分群較分散，影響數(shù)據(jù)分析。因此，當(dāng)您發(fā)現(xiàn)在跑了36個(gè)循環(huán)時(shí)信號(hào)值較低，分群較分散但有分群趨勢(shì)，即可選擇加循環(huán)（94度--20秒，57度--60秒，3個(gè)循環(huán)）。如果NTC沒(méi)有擴(kuò)增，最多可加4次循環(huán)。
7. KASP 試劑的儲(chǔ)存條件及建議是什么？
KASP 引物及Master mix 可在4度保存一周，建議儲(chǔ)存在-20度/-80度， Master mix需避光保存， 避免反復(fù)凍融（盡量?jī)鋈诓灰^(guò)3次），建議事先將其分裝。保存得當(dāng)，可延長(zhǎng)KASP試劑的使用壽命至2-3年。
8. 用qPCR儀做KASP genotyping, 有哪些注意事項(xiàng)？?
請(qǐng)確定您的qPCR儀型號(hào)，訂購(gòu)合適ROX水平的Master mix。請(qǐng)?jiān)?0度以下讀取KASP的終點(diǎn)熒光信號(hào)，分析數(shù)據(jù)時(shí)請(qǐng)注意調(diào)整XY坐標(biāo)軸最大最小值相當(dāng)。所有數(shù)據(jù)均建議在Autocall 后進(jìn)行人工判讀。如有可能，建議樣品板中加陽(yáng)性對(duì)照DNA。
9. 目標(biāo)片段GC含量太高或太低有什么建議？?
對(duì)于高GC含量片段（GC%>65%）的擴(kuò)增，建議首先嘗試把標(biāo)準(zhǔn)的touch down 程序(61oC-55oC) 改成68oC-62oC。如果效果不好，再嘗試加5%-10%Master mix 體積的DMSO。關(guān)于低GC含量的片段擴(kuò)增（GC%<40%），建議首先嘗試將touchdown 取消，改為兩步法。如果效果不好，再嘗試加0.63% 或1.06% Master mix 體積的MgCl2。?
10. 反應(yīng)完成后的PCR板還可保存多長(zhǎng)時(shí)間？?
反應(yīng)完成后的PCR板可在4度保存一周，熒光信號(hào)仍會(huì)比較穩(wěn)定。一周之內(nèi)加循環(huán)或重讀數(shù)據(jù)均可。?
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