腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)
腫瘤藥理實(shí)驗(yàn)方法無(wú)外乎體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)兩種。從實(shí)驗(yàn)?zāi)康纳峡?，又可以分成抗癌作用和抗癌作用機(jī)制研究?jī)煞N。
一、抗癌作用研究
（一）體外實(shí)驗(yàn)法：用培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞系進(jìn)行。
1、噻唑藍(lán)（MTT）法 ?在培養(yǎng)的活細(xì)胞線粒體中與NADP相關(guān)的脫氫酶可將黃色的四氮唑（MTT）催化成不溶性的藍(lán)紫色的甲替，將甲替用二甲基亞砜（DMSO）溶解后，利用酶標(biāo)儀（試驗(yàn)波長(zhǎng)570nm，參比波長(zhǎng)450nm）測(cè)定光密度值，按照公式
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?實(shí)驗(yàn)組光密度值
腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（1 - ?——————————）×100%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?對(duì)照組光密度值
?
計(jì)算藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制率。用系列濃度的藥物可制作腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率的量效曲線。
2、染料排斥法 ?本方法是根據(jù)活細(xì)胞具有排斥某些染料的功能，而死細(xì)胞因胞膜破壞而易于被染料著色的原理，在培養(yǎng)的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞懸液中加入伊紅、臺(tái)盼藍(lán)、或苯胺黑等染料，在室溫下放置5分鐘后，在15分鐘用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞。根據(jù)公式
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?未染細(xì)胞數(shù)
活細(xì)胞率（%）= ——————×100%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 細(xì)胞總數(shù)
?
3、生長(zhǎng)曲線法 ?本方法是根據(jù)腫瘤的Gompertzian生長(zhǎng)曲線而設(shè)計(jì)。培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞在初期為指數(shù)增殖期，隨著細(xì)胞密度的增加，因代謝產(chǎn)物的積聚和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，增殖趨于減緩乃至停止，進(jìn)入所謂的平臺(tái)期。在培養(yǎng)后的的即刻、1、2、3、4、5、7天的細(xì)胞，用臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞計(jì)數(shù)，然后取細(xì)胞對(duì)數(shù)對(duì)培養(yǎng)時(shí)間作圖可獲細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。1）將生長(zhǎng)曲線外延至Y軸可獲得截距No`，用公式
?
?
計(jì)算藥物對(duì)增殖細(xì)胞的殺傷力（No`是對(duì)照組的的截距）
2）用Nt代表接種后t小時(shí)的細(xì)胞數(shù)， 用公式
TD = 0.301t / logNt - LogNo ??
?計(jì)算藥物對(duì)細(xì)胞增增時(shí)間（TD）的影響。
3）取平臺(tái)期每毫升的細(xì)胞均數(shù)，比較細(xì)胞生長(zhǎng)的飽合密度（Ns）。
4、集落形成法 ?本方法利用分裂6代以上的克隆原單細(xì)胞子細(xì)胞可形成集落成簇（每簇細(xì)胞數(shù)＞50）的能力，比較藥物對(duì)單個(gè)腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響。本方法有貼壁法和半固體培養(yǎng)法兩種。
1）貼壁法 ?需要選用貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞， 按500細(xì)胞/ml的濃度接種到35mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)后棄去培養(yǎng)基，用瑞氏-姬姆薩染色后，在20×解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)含有50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞集落。
2）半固體軟瓊脂培養(yǎng)法 ?取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞，用含小牛血清的培養(yǎng)液稀釋成1000細(xì)胞/ml的懸液；溶化5%的瓊脂液，并按1：9的比例與含小牛血清的新鮮培養(yǎng)液混合，倒入35mm培養(yǎng)皿（1ml/皿），室溫下待瓊脂凝固，取0.94ml的細(xì)胞懸液，加0.04ml的5%瓊脂, 加到已制備的瓊脂平皿中，室溫下凝固。移入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。在16×解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)直徑大于75μm的細(xì)胞集落。以集落形成抑制百分率對(duì)對(duì)數(shù)劑量作圖，可得“S”型曲線，從曲線上求取半數(shù)抑制濃度IC50；以集落的存活分?jǐn)?shù)與劑量作圖，可獲得克隆原細(xì)胞存活曲線，方程為S=1-(1-e-D/Do)n，S為存活分?jǐn)?shù)， D 為劑量， Do為存活分?jǐn)?shù)每下降1/?e時(shí)所需的藥物劑量， n為外推值。Do越小， 藥物的殺傷力越大，N越大殺死細(xì)胞的藥物劑量越大。
5、硫化若丹明B法（SRB）法 ?硫化若丹明（sulforhamine B）呈粉紅色，溶于水，可與生物大分子的堿性氨基酸結(jié)合，這種結(jié)合物在波長(zhǎng)515nm時(shí)的讀數(shù)與細(xì)胞表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，可用于細(xì)胞的定量。測(cè)試的細(xì)胞先用TCA固定，去除固定液，加入SRB， 室溫下靜置， 然后去除未結(jié)合的SRB， 用非緩沖tris堿液溶解結(jié)合的SRB，在自動(dòng)化分光光度平板讀數(shù)儀（515nm波長(zhǎng)）測(cè)定OD值。可根據(jù)下述公式計(jì)算:
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? T - T0
??生長(zhǎng)率（%）= ?——————?×100%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C - T0
?
C、T和To分別為對(duì)照組細(xì)胞，為給藥組細(xì)胞，另外的對(duì)照平板加藥時(shí)的細(xì)胞的OD值。
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?T - T0
殺傷率(%) =?——————?×100%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?T
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? T - T0
50%生長(zhǎng)抑制所需的藥物濃度(GI50) =?——————×100%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? C - T0
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?T - T0
殺死50%細(xì)胞所需的藥物濃度(LC50)=??——————×100%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?T0
?
(二) 在體試驗(yàn)法
1、小鼠白血病L1210 ?系用甲基膽蒽誘發(fā)DBA/2小鼠而得。取接種于DBA/2小鼠第6～7天之腹水，制成細(xì)胞懸液，每只小鼠（DBF1或CDF1）腹腔接種活細(xì)胞1×105，觀察體重變化，計(jì)算平均存活時(shí)間T/C（T--治療組存活時(shí)間，C--對(duì)照組存活時(shí)間）。T/C大于125%，并可重復(fù)，認(rèn)為有抗癌活性，T/C大于150%，并可重復(fù)，認(rèn)為具有顯著活性。
2、大鼠Walker-256瘤 ?本瘤細(xì)胞接種在皮下或肌肉成為實(shí)體瘤，接種于腹腔則成為腹水瘤。取Walker-256瘤體制成瘤細(xì)胞懸液，按106個(gè)細(xì)胞接種于大鼠大腿肌肉。計(jì)算瘤重和T/C。重復(fù)實(shí)驗(yàn)T/C≤42%，認(rèn)為有活性。
3、Lewis 肺癌 ?是一個(gè)在C57BL/6小鼠上發(fā)現(xiàn)的自發(fā)性肺內(nèi)未分化的上皮樣癌。該癌細(xì)胞惡性程度高，皮下、肌肉接種對(duì)藥物的敏感性低，但可向肺轉(zhuǎn)移，靜脈接種可在肺形成瘤集落。方法是取接種于C57BL/6小鼠肌肉或腋窩皮下的13～15天的Lewis肺癌，制成細(xì)胞懸液接種2×106個(gè)細(xì)胞于BDF1小鼠皮下或腹腔內(nèi)，12天后處死動(dòng)物，作皮下接種者直接摘取腫瘤稱重，作腹腔接種者，將雙側(cè)后肢從髖關(guān)節(jié)處剪下，荷瘤肢重減去正常肢重即為瘤重。重復(fù)實(shí)驗(yàn)T/C≤42%為有活性。
二、抗癌作用機(jī)制研究
（一）藥物作用周期特異性研究
進(jìn)行藥物作用細(xì)胞周期性實(shí)驗(yàn)必須首先制備同步化的細(xì)胞，常用的體外培養(yǎng)細(xì)胞同步化的方法有機(jī)械振蕩法、雙胸苷同步法、含羞草氨酸俘獲法和離心洗脫法。
1、機(jī)械振蕩法 ??機(jī)械振蕩法分離同步化細(xì)胞是基于單層貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞在進(jìn)入有絲分裂期時(shí), 胞形變圓，松散地附在支持物上，利用搖晃或拍擊培養(yǎng)瓶可以剝離出這些細(xì)胞，利用此方法可以得到較純的M 期細(xì)胞。雙胸苷同步法的原理是先以高濃度的TdR處理細(xì)胞，使細(xì)胞內(nèi)的dTTP升高，后者抑制CDP 向dCDP的轉(zhuǎn)變，DNA復(fù)制受阻，S期細(xì)胞停滯在S 期，其它期細(xì)胞積聚在G1/S邊界；撤TdR，讓原處于S期的細(xì)胞完全越過(guò)S期，再給予TdR，讓越過(guò)S期的細(xì)胞進(jìn)入G1/S邊界，然后撤去TdR，讓細(xì)胞重新生長(zhǎng)，同時(shí)進(jìn)入S期。因此，本方法可以得到較純的S期細(xì)胞。
2、含羞草氨酸俘獲法 ??含羞草氨酸可將細(xì)胞集結(jié)于G1/S邊界，阻止細(xì)胞進(jìn)入S期。在撤除含羞草氨酸后，細(xì)胞可同步進(jìn)入S 期。
3、離心洗脫法 ?離心洗脫法的原理是進(jìn)入細(xì)胞周期的的體積呈線性增加。G1期細(xì)胞體積小，離出口近而被zui先洗出。G2/M細(xì)胞體積大離進(jìn)氣口近而被后洗出。
在上述同步化處理尚需配合以同步化程度的檢測(cè)，檢查的方法有兩種：流式細(xì)胞光度技術(shù)和放射性同位素技術(shù)。前者通過(guò)測(cè)定細(xì)胞的熒光強(qiáng)度來(lái)定量細(xì)胞的DNA量； 后者則利用測(cè)定摻入到DNA中的3H-胸苷（3H-TdR）或溴脫氧尿苷（BrdU）的量來(lái)獲知處于S 期的細(xì)胞量。
（二）藥物抗微管作用 ??利用微管蛋白在37℃聚合，在冰浴上解聚的特點(diǎn)，測(cè)定微管蛋白或微管液的OD值，分別獲得S型的聚合曲線和倒S型的解聚曲線， 比較藥物對(duì)曲線的影響， 用下式計(jì)算抑制率。
?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 實(shí)驗(yàn)組光密度值
抑制率（%）=（1 - ?——————————?）×100%
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?對(duì)照組光密度值
?
（三）藥物與DNA結(jié)合能力檢查 ?
吸收光譜移動(dòng)法 ?原理是DNA與藥物形成復(fù)合物后吸收光譜發(fā)生改變，吸收峰產(chǎn)生位移，位移波長(zhǎng)隨DNA/ 藥物復(fù)合物的量增加而增加。利用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，可觀察到這些改變。
熒光光譜移動(dòng)法 ??原理是在激發(fā)光的激發(fā)下，DNA-藥物復(fù)合物的熒光發(fā)射光譜發(fā)生改變，譜峰向短波方向移動(dòng)，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，同時(shí)激發(fā)光譜說(shuō)發(fā)生改變。用熒光分光光度計(jì)測(cè)定激發(fā)光譜和發(fā)射光譜可觀察到這些變化。
（四）藥物造成的DNA損傷
彗星（Comet）微凝膠單細(xì)胞電泳法 ?正常的DNA為負(fù)超螺旋結(jié)構(gòu)， ?在pH<9.0時(shí)以雙鏈形式存在, 在pH>12.0時(shí)則完全解鏈。DNA受損后鏈斷裂, 成為一個(gè)松散的結(jié)構(gòu), 在電場(chǎng)的作用下,松散的DNA離開(kāi)細(xì)胞核向正極移動(dòng), 形成彗星似的拖尾,變換不同pH緩沖液可檢測(cè)斷裂的是雙鏈還是單鏈。
堿洗脫法 ??收集細(xì)胞于濾膜上，用細(xì)胞溶解液裂解細(xì)胞并洗去RNA和蛋白質(zhì)，暴露DNA，用洗脫液進(jìn)行洗脫，若DNA發(fā)生鏈斷裂，則易于經(jīng)濾膜洗出。
（五）藥物對(duì)DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶的影響
DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶是調(diào)節(jié)DNA空間結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化的關(guān)鍵性核酶，分成拓?fù)洚悩?gòu)酶I和II，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I可以造成DNA的單鏈斷裂，抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶II，可造成雙鏈斷裂，進(jìn)而干擾DNA的復(fù)制、重組和基因表達(dá)。實(shí)驗(yàn)的原理是用從腫瘤細(xì)胞核提取的拓?fù)洚悩?gòu)酶II處理PBR322DNA，后者是一種質(zhì)粒DNA，主要存在有超螺旋、缺口狀和線性DNA三種形式，瓊脂糖電泳上顯示出三條帶，在拓?fù)洚悩?gòu)酶的作用下超螺旋DNA解旋、斷裂，電泳時(shí)超螺旋帶減弱或消失，相應(yīng)的缺口環(huán)狀或線性DNA增加。如果藥物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶具有抑制作用，則可見(jiàn)超螺旋帶保留。此方法亦可改進(jìn)為觀察藥物對(duì)拓?fù)洚悩?gòu)酶功能的促進(jìn)和抑制作用。方法是選定不能使一定量DNA完全斷裂量的拓?fù)洚悩?gòu)酶處理PBR322DNA后電泳可見(jiàn)超螺旋帶，同時(shí)加入不同濃度的藥物，如果藥物抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶，則超螺旋帶增強(qiáng)，若藥物增強(qiáng)拓?fù)洚悩?gòu)酶活性，則見(jiàn)螺旋帶減弱或消失。
（六）藥物對(duì)細(xì)胞核酸代謝的影響 DNA和RNA合成均需要特殊氨基酸，用同位素標(biāo)記前體物如3H-TdR，3H-UR可分別摻入到細(xì)胞DNA 和RNA中去， 用液閃法測(cè)定其同位素活性則可知細(xì)胞DNA和RNA 的合成情況。
（七）藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用
細(xì)胞凋亡是一種受基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡過(guò)程，細(xì)胞凋亡時(shí)表現(xiàn)為細(xì)胞體縮小，染色質(zhì)濃縮成大小不等的塊狀，并裂解為小片段。DNA斷裂長(zhǎng)度為核小體核苷酸長(zhǎng)度(180～200堿基對(duì))的整倍數(shù)，提取后普通的瓊脂糖電泳表現(xiàn)為特殊的云梯狀，凋亡小體形成。檢查細(xì)胞凋亡的方法有：
1、熒光顯微鏡的形態(tài)學(xué)檢查 ??該方法是利用凋亡細(xì)胞染色質(zhì)濃縮，DNA廣泛裂解的特征和熒光化合物可嵌入DNA分子或以靜電相互作用與DNA分子結(jié)合的原理，建立DNA的熒光探針。常用的方法是用Hoechst33342和PI聯(lián)合染色，然后在熒光顯微下用紫外光激發(fā)。凋亡的細(xì)胞對(duì)Hoechst33342具有高攝取比，加之染色質(zhì)的高度濃縮，呈強(qiáng)藍(lán)色熒光；正常細(xì)胞呈微弱熒光，壞死細(xì)胞則呈紅色熒光（被PI染色）。
2、流式細(xì)胞光度術(shù) ??該方法的原理是用DNA結(jié)合性的熒光染料標(biāo)記DNA， 因?yàn)榧?xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶降解、斷裂DNA，斷裂生成的小分子量DNA溢出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)DNA總量降低，利用流式細(xì)胞光度術(shù)可以檢測(cè)出DNA的這種結(jié)構(gòu)和量的變化。
3、瓊脂糖電泳分析法 ??利用該方法可檢測(cè)出呈云梯狀的寡聚核小體。
