磁珠法核酸提取裂解液常用試劑及作用原理介紹
磁珠法核酸提取是以納米生物磁珠為載體的一種新型核酸提取技術(shù)，核酸分子可與磁珠表面的硅羥基發(fā)生特異性識別與結(jié)合，在外部磁場的作用下發(fā)生聚集或分散，徹底擺脫傳統(tǒng)核酸提取過程中離心、抽取上清液等手工操作流程，從而實現(xiàn)核酸的自動化提取。廣泛應用于臨床疾病診斷、輸血安全、法醫(yī)學鑒定、環(huán)境微生物檢測、食品安全檢測、分子生物學研究等多種領(lǐng)域。
磁珠法核酸提取一般包括裂解、結(jié)合、洗滌、洗脫四個主要步驟，每一步驟又可由多種不同的方法單獨或聯(lián)合實現(xiàn)，其中裂解環(huán)節(jié)是決定提取之質(zhì)量的重中之重，經(jīng)常也會有老師問到應該如何對裂解液進行優(yōu)化。那么，我們就來分析一下配置裂解液經(jīng)常用的試劑及其作用原理。
1、鹽酸胍、尿素
鹽酸胍在濃度為4-8mol時可斷裂氫鍵，有兩種可能機制：1、變性蛋白和鹽酸胍、尿素優(yōu)先結(jié)合，形成變性蛋白-變性劑復合物，當復合物被除去，引起N-D反應平衡向右移動，隨著變性劑濃度增加，天然狀態(tài)的蛋白不斷轉(zhuǎn)變?yōu)閺秃衔铮罱K導致蛋白質(zhì)完全變性；2、鹽酸胍、尿素對氨基酸具有增溶作用，能形成氫鍵，當濃度高時，能破壞水的氫鍵結(jié)構(gòu)，成為非極性殘基的較好溶劑，使蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水殘基伸展和溶解性加強，鹽酸胍、尿素引起的蛋白變性往往是不可逆的。
同時鹽酸胍是一個核酸酶的強抑制劑，但并不是一種足夠強的變性劑，可以允許完整的RNA從富含RNase的組織中提取出來。高濃度尿素同樣可以使使蛋白質(zhì)變性并抑制Rnase活性。
2、異硫氰酸胍
蛋白質(zhì)變性劑，能迅速溶解蛋白質(zhì)，導致細胞結(jié)構(gòu)破碎，核蛋白由于其二級結(jié)構(gòu)的破壞消失而迅速與核酸分離。在通常使用的蛋白質(zhì)變性劑中作用最強的是異硫氰酸胍，它們可以使多數(shù)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換成一種隨機的卷曲狀態(tài)。含有強力的陰離子和陽離子基團，它們可以形成較強的氫鍵。在還原劑存在的情況下，異硫氰酸胍可以斷裂氫鍵，而去垢劑，如SDS存在的情況下，可以破壞疏水作用。
3、二硫蘇糖醇（DTT）
二硫蘇糖醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵，使Rna酶變性，同時抑制酚類氧化引起的磷酸二酯鍵的斷裂及導致RNA和DNA的交聯(lián)。
二硫蘇糖醇刺激性氣味不大，毒性較低。由于容易被空氣氧化，因此DTT的穩(wěn)定性較差；但冷凍保存或在惰性氣體中處理能夠延長它的使用壽命。由于質(zhì)子化的硫的親核性較低，隨著pH值的降低，DTT的有效還原性也隨之降低；DTT或含有DTT的溶液不能進行高壓處理。
4、蛋白酶K
一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵。此酶經(jīng)純化去除了RNA酶和DNA酶活性。由于蛋白酶K在尿素和SDS中穩(wěn)定，還具有降解天然蛋白質(zhì)的能力，因而它應用很廣泛，包括制備脈沖電泳的染色體DNA，蛋白質(zhì)印跡以及去除DNA和RNA制備中的核酸酶。蛋白酶K的一般工作濃度是50—100μg/ml。在較廣的pH范圍內(nèi)（pH 4-12.5）均有活性。
以上是裂解液中常用的試劑，在實際操作中針對不同的樣本（植物組織、動物組織、全血、血清、質(zhì)粒）應配制不同濃度的裂解緩沖液，并根據(jù)樣本的狀態(tài)（質(zhì)量、體積）及期望達到的實驗結(jié)果（核酸的濃度、OD比值）對裂解液的濃度進行調(diào)整，此外，還要對結(jié)合、洗滌、洗脫三個步驟進行優(yōu)化，從而得到較完美的核酸提取方案。
