實驗室測定蛋白質(zhì)分子量的方法有哪些
測定蛋白質(zhì)分子量的常用方法：
粘度法、凝膠過濾層析法、凝膠滲透色譜法、SDS-凝膠電泳、滲透壓法、質(zhì)譜法包括電噴霧離子化質(zhì)譜技術和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術、光散射法（多角度激光散射）、沉降法（超速離心法）。
1、粘度法?
一定溫度條件下，高聚物稀溶液的粘度與其分子量之間呈正相關性，隨著分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。通過測定高聚物稀溶液粘度隨濃度的變化，即可計算出其平均分子量(粘均分子量)。?
如果高聚物分子的分子量愈大，則它與溶劑間的接觸表面也愈大，摩擦就大，表現(xiàn)出的特性粘度也大。特性粘度和分子量之間的經(jīng)驗關系式為：
優(yōu)缺點：該方法操作簡單、設備價格較低，通常不需要標準樣品，但無法測定聚合物的分子量分布。?
2、凝膠過濾層析法?
對同一類型的化合物，洗脫特性與組分的分子量有關，流過凝膠柱時，按分子量大小順序流出，分子量大的走在前面。Ve與分子量的關系可用下式表示： ? ? ?V e=K1—K2logMr ?
K1與K2為常數(shù)，Mr為分子量，Ve也可用Ve—Vo（分離體積），Ve/Vo（相對保留體積），Ve/Vt（簡化的洗脫體積，它受柱的填充情況的影響較?。┗騅av代替，與分子量的關系同上式，只是常數(shù)不同。凝膠層析主要決定于溶質(zhì)分子的大小，每一類型的化合物如球蛋白類，右旋糖酐類等都有它自己的特殊的選擇曲線，可用以測定未知物的分子量，測定時以使用曲線的直線部分為宜。
優(yōu)缺點：凝膠層析技術操作方便，設備簡單，樣品用量少，周期短，重復性能好，條件溫和，一般不引起生物活性物質(zhì)的變化，而且有時不需要純物質(zhì)，用一粗制品即可，目前已得到相當廣泛的應用。凝膠層析法測定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范圍內(nèi)，線性關系比較好，但在極端pH時，一般蛋白質(zhì)有可能因變性而偏離。糖蛋白在含糖量超過5%時，測得分子量比真實的要大，鐵蛋白則與此相反，測得的分子量比真實的要小。 ?
3、凝膠滲透色譜法?
分子量的多分散性是高聚物的基本特征之一。聚合物的性能與其分子量和分子量分布密切相關。
SEC法是按分子尺寸大小分離的，即淋出體積與分子線團體積有關，利用Flory的粘度公式：?
K1、K2、α1、α2可以從手冊查到，從而由第一種聚合物的M-Ve校正曲線，換算成第二種聚合物的M-Ve曲線，即從聚苯乙稀標樣作出的M-Ve校正曲線，可以換算成各種聚合物的校正曲線。
優(yōu)缺點：凝膠滲透色譜法分離速度快、分析時間短、重現(xiàn)性好，進樣量少、自動化程度高。但設備投入較大，價格較高。 ?
4、SDS-凝膠電泳法?
SDS是十二烷基硫酸鈉的簡稱，它是一種陰離子表面活性劑，加入到電泳系統(tǒng)中能使蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水鍵打開，并結合到蛋白質(zhì)分子上（在一定條件下，大多數(shù)蛋白質(zhì)與SDS的結合比為1.4gSDS/1g蛋白質(zhì)），使各種蛋白質(zhì)-SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，其數(shù)量遠遠超過了蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，從而使其電泳遷移率只取決于分子大小這一因素，根據(jù)標準蛋白質(zhì)分子量的對數(shù)和遷移率所作的標準曲線，可求得未知物的分子量。
優(yōu)缺點：實驗成本較低，儀器設備也相對很簡單，一套電泳裝置即可。但是精確程度相對較低，好的電泳圖譜需要一定的技術。?
5、滲透壓法?
在一種理想溶液中，滲透壓與溶質(zhì)濃度成正比。但是實際上蛋白質(zhì)溶液與理想溶液有較大的偏差。在溶質(zhì)濃度不大時，它們的關系可用下式表示：
當c 趨向于0時，RTKc 趨向于0，但π/c 不趨向于0，而是趨向于一定值。測定幾個不同濃度下的滲透壓，以π/c對c作圖，并外推至c為0時的π/c，再代入上式求得Mr。
優(yōu)缺點：操作簡單、快捷，實驗成本低，但準確度較差，受外界溫度影響較大，且要準確配置蛋白質(zhì)溶液。
6、超速離心沉降法?
利用超速離心沉降法測蛋白質(zhì)的分子量是在較低離心轉(zhuǎn)速下進行的（8000～20000r/min），離心開始時，分子顆粒發(fā)生沉降，一段時間以后，沉降的結果造成了濃度梯度，因而產(chǎn)生了蛋白質(zhì)分子反向擴散運動，當反向擴散與離心沉降達到平衡時，濃度梯度就固定不變了。 ?
7、光散射法?
主要基于染料陰離子在蛋白質(zhì)等電點前與肽鏈上帶正電荷的基團上的結合作用.。此時生色團聚集于蛋白質(zhì)分子上引起共振散射光增強，它與核酸不同的是生色團必須是帶負電荷的陰離子。?
8、電噴霧離子化質(zhì)譜技術?
電噴霧離子化質(zhì)譜技術（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相的質(zhì)譜技術。ESI-MS 測定蛋白質(zhì)大分子是根據(jù)一簇多電荷的質(zhì)譜峰群，通過解卷積的方式計算得到蛋白質(zhì)的分子量，由于ESI-MS可以產(chǎn)生多電荷峰，因此使得測試的分子質(zhì)量范圍大大擴大。
優(yōu)缺點：（1）對樣品的消耗少，不會造成樣品的大量浪費；（2）對樣品分子質(zhì)量測試靈敏度、分辨力和準確度都相當高；（3）能夠方便地與多種分離技術聯(lián)用，如毛細管電泳、高效液相色譜等，是解決非揮發(fā)性、熱不穩(wěn)定性、極性強的復雜組分化合物的定性定量的高靈敏度檢測方法。 ?
9、基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術?
基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜技術（MALDI-MS）是將待測物懸浮或溶解在一個基體中，基體與待測物形成混晶，當基體吸收激光的能量后，均勻傳遞給待測物，使待測物瞬間氣化并離子化?；w的作用在于保護待測物不會因過強的激光能量導致化合物被破壞。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時間成正比，檢測離子。
優(yōu)缺點：（1）同ESI-MS 一樣對樣品的消耗很少；（2）隨著質(zhì)量分析器的不斷改進、新的基質(zhì)的不斷發(fā)現(xiàn)和應用以及延遲萃取技術的使用，使得MALDI-MS 的最高分辨率不斷提高，甚至超過ESI-MS；（3）MALDI-MS 單電荷峰占主要部分，碎片峰少，非常有利于對復雜混合物的分析，且能忍受較高濃度的鹽、緩沖劑和其他難揮發(fā)成分，降低了對樣品預處理的要求；（4）MALDI-TOF 質(zhì)譜對生物大分子分子量的測定范圍是所有測試技術中最廣的。
