重組蛋白藥物是用基因重組技術(shù)，獲得連接有可以翻譯成目的蛋白基因片段的重組載體，將其轉(zhuǎn)入可以表達(dá)目的蛋白的宿主細(xì)胞從而表達(dá)特定的重組蛋白分子，用于彌補(bǔ)機(jī)體由于先天基因缺陷或后天疾病等造成的體內(nèi)相應(yīng)功能蛋白的缺失。

重組蛋白藥物主要包括細(xì)胞因子、激素、酶、融合蛋白等，由于重組蛋白藥物生產(chǎn)工藝的復(fù)雜性及結(jié)構(gòu)的相對(duì)不穩(wěn)定性，終產(chǎn)品中的目的蛋白常常不以單一的形式存在，在性質(zhì)上存在不均一性，這種異質(zhì)性對(duì)于重組蛋白類藥物的溶解性、穩(wěn)定性、免疫原性、體內(nèi)外生物活性、藥物動(dòng)力學(xué)發(fā)揮著關(guān)鍵影響，因此選擇合適的方式進(jìn)行檢測(cè)至關(guān)重要。

促紅細(xì)胞生成素

促紅細(xì)胞生成素（EPO）是一種由腎臟自然生成對(duì)紅細(xì)胞的刺激性激素，也是首批商業(yè)化治療貧血的重組糖蛋白之一。EPO在主要蛋白序列的N端和O端有復(fù)雜的糖基化修飾，因此EPO存在多種電荷異構(gòu)體。1999年，歐洲藥典首次明確使用毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE的方法進(jìn)行EPO不同電荷分布異構(gòu)體的定量檢測(cè)。隨后，世界各地的制藥公司、政府機(jī)構(gòu)和學(xué)術(shù)界的合作研究改進(jìn)了這一方法，并開發(fā)了EPO系統(tǒng)適應(yīng)性的標(biāo)準(zhǔn)。

SCIEX 的毛細(xì)管電泳PA 800 Plus制藥分析系統(tǒng)，通過毛細(xì)管兩端軌道的移動(dòng)完成換液，可以完成毛細(xì)管凝膠電泳CGE、區(qū)帶電泳CZE、等點(diǎn)聚焦電泳cIEF等多種電泳模式，靈活地進(jìn)行各類生物藥的異質(zhì)性檢測(cè)及分析。對(duì)于EPO可進(jìn)行符合中國(guó)藥典和歐洲藥典的cIEF&CZE電荷異構(gòu)體檢測(cè)。

SCIEX 毛細(xì)管電泳PA 800 Plus制藥分析系統(tǒng)

歐洲藥典EPO參考標(biāo)準(zhǔn)品PA 800 Plus CZE電泳圖

毛細(xì)管區(qū)帶電泳CZE的方法耗時(shí)較長(zhǎng)，僅分離就需要60 min，而使用PA 800 Plus 則可以通過更換分離緩沖液及電泳模式，完成EPO的快速電荷異質(zhì)性檢測(cè)。采用快速CZE方法分離只需36min，而中國(guó)藥典的cIEF方法只需30min。

EPO的快速CZE檢測(cè)電泳圖譜

EPO的cIEF檢測(cè)電泳圖譜

重組人生長(zhǎng)激素

重組人生長(zhǎng)激素（hGH）是由大腸桿菌或是酵母菌表達(dá)的一種重要的非糖基化蛋白質(zhì)激素，由191個(gè)氨基酸組成的蛋白，蛋白分子量為22 kDa。臨床上，主要用于治療內(nèi)源性生長(zhǎng)激素缺乏而導(dǎo)致的兒童期生長(zhǎng)障礙和成年期生長(zhǎng)激素缺乏癥。2006年1月，基于多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的聯(lián)合驗(yàn)證，歐洲藥典使用CZE的方法進(jìn)行生長(zhǎng)激素電荷相關(guān)雜質(zhì)的控制，并證實(shí)了CZE方法具有更高的靈敏度和重現(xiàn)性。

PA 800 Plus可以使用歐洲藥典的CZE方法完成生長(zhǎng)激素的電荷異質(zhì)性檢測(cè)，并且在歐洲藥典及美國(guó)藥典的標(biāo)準(zhǔn)品上得到了驗(yàn)證。電泳圖譜與歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn)品的描述相匹配，包括：在主峰前后均有兩個(gè)明顯的異構(gòu)體峰；其中，P2為裂解形式，P3為Gln-18突變，P4為脫酰胺形式，洗脫為雙峰，均是異構(gòu)體的關(guān)鍵雜質(zhì)。

美國(guó)藥典（紅色曲線）和

歐洲藥典hGH標(biāo)準(zhǔn)品（藍(lán)色曲線）

在PA 800 Plus上進(jìn)行的CZE檢測(cè)的電泳圖譜

重組人干擾素α2b

重組人干擾素為全球第二大重組蛋白藥物，其中重組人干擾素α2b（IFN-α2b）是一種重要的免疫相關(guān)蛋白，主要用于治療病毒性疾病和腫瘤，如乙型肝炎、帶狀皰疹毛細(xì)胞白血病等。

IFN-α2b是一種165個(gè)氨基酸的單鏈多肽，分子量為19.26 kDa，一般是采用分子排阻色譜法及凝膠電泳來控制原液中的純度。SCIEX 開發(fā)了利用LC/Q-TOF在其完整蛋白的水平及多肽水平對(duì)其異構(gòu)體進(jìn)行檢測(cè)的方案。

對(duì)四個(gè)IFN-α2b樣品進(jìn)行LC/Q-TOF分子量的檢測(cè)，根據(jù)理論與實(shí)際檢測(cè)出的分子量差異，推算出的相關(guān)的翻譯后修飾情況。

IFN-α2b樣本的去卷積質(zhì)譜圖

為了進(jìn)一步分析分子異質(zhì)性，用胰蛋白酶消化IFN-α2b樣品，在肽段水平上進(jìn)行分析，可以發(fā)現(xiàn)，樣本4E（藍(lán)峰）存在+Met及乙?；漠悩?gòu)體。

IFN-α2b樣本的肽圖

SCIEX 2021年最新推出的高分辨質(zhì)譜ZenoTOF? 7600系統(tǒng)可以完成重組蛋白藥物的結(jié)構(gòu)表征。該系統(tǒng)擁有Zeno? trap(Zeno 阱)和電子活化解離(EAD)碎片技術(shù)；Zeno trap克服了正交TOF技術(shù)在傳統(tǒng)上占空比挑戰(zhàn)，可以提升二級(jí)碎片高達(dá)20倍的靈敏度；可調(diào)節(jié)的EAD碎裂技術(shù)，確?？梢詮牟煌幕衔镱愋椭蝎@得新穎的結(jié)構(gòu)信息并進(jìn)行定量定性。

高分辨質(zhì)譜ZenoTOF? 7600系統(tǒng)

Etanercept 依那西普

依那西普是一種結(jié)合腫瘤壞死因子 (TNF) 的二聚體融合蛋白，為 TNF 抑制劑。Etanercept 競(jìng)爭(zhēng)性地抑制 TNF-α 和 TNF-β 與細(xì)胞表面 TNF 受體的結(jié)合，使腫瘤壞死因子在生物學(xué)上失去活性。依那西普主要用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎和斑塊性銀屑病等的治療。

反相色譜法是進(jìn)行融合蛋白純度檢測(cè)的一種可行方法，艾杰爾-飛諾美采用bioZen 2.6 μm  WidePore C4色譜柱，通過簡(jiǎn)單的梯度程序調(diào)整，優(yōu)化容量因子和保留時(shí)間，可以對(duì)依那西普的純度進(jìn)行檢測(cè)。

依那西普完整蛋白和還原蛋白的色譜圖

艾杰爾-飛諾美bioZen  WidePore C4 色譜柱結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

艾杰爾-飛諾美bioZen系列色譜柱，擁有丁基固定相以及更優(yōu)孔徑分布的核-殼顆粒，能夠確保大分子分離的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

此外，重組蛋白還常常出現(xiàn)復(fù)雜的翻譯后修飾，具有部分依賴二硫鍵的高度特異的三維結(jié)構(gòu)，并且可能發(fā)生聚集、吸附和截短。準(zhǔn)確的氨基酸序列、分子量、價(jià)態(tài)變化、糖基化、聚集水平以及氧化水平都是蛋白質(zhì)藥物表征的關(guān)鍵要素。因此，全面的化學(xué)、物理和構(gòu)像表征對(duì)于了解重組蛋白藥物的異質(zhì)性、雜質(zhì)譜和有效性是非常必要的。丹納赫生命科學(xué)旗下艾杰爾-飛諾美和SCIEX能在重組蛋白藥的表征上提供全面的解決方案。