磁質(zhì)譜儀在哺乳動物細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

磁質(zhì)譜和四級桿這兩種類型的質(zhì)譜儀已用于監(jiān)測哺乳動物細胞培養(yǎng)過程。

HaiYuan Goh等于2019年發(fā)表相關(guān)文章介紹了他們的相關(guān)研究。在5L和50L規(guī)模反應(yīng)器進行Fed-batch培養(yǎng)過程中，使用磁質(zhì)譜儀 (Thermo Scientific, Prima BT Mass Spectrometer) 進行相關(guān)氣體分析。整個細胞培養(yǎng)過程通過切換進氣中壓縮空氣、純氧以及氮氣組分控制溶解氧維持在30%±1%。在這種模式下，作者發(fā)現(xiàn)活細胞濃度（VCC）與進入反應(yīng)器的進氣氧氣濃度之間的相關(guān)系數(shù)R²?0.9; 因此，進氣O₂組分可以表征VCC。通過計算的OUR和溶解氧數(shù)據(jù)，可以對體積氧傳質(zhì)系數(shù)（k_La）進行定量，在整個培養(yǎng)期間，發(fā)現(xiàn)在不同的時間點添加消泡劑均會降低k_La；實時計算的整個生物反應(yīng)器運行期間的特定耗氧率（q_O2）為2-20 pmol /細胞/天，也與之前文獻報道關(guān)于哺乳動物細胞氧消耗速率范圍一致。同時，該文章第一次報道了呼吸商（RQ）和細胞培養(yǎng)代謝狀態(tài)之間的相關(guān)性：在乳酸產(chǎn)生階段平均RQ> 1，和乳酸消耗階段平均RQ<1。

Thermo Scientific? Prima 質(zhì)譜儀系列中的扇形磁場分析器由層壓材料組成，可快速、穩(wěn)定地分析無數(shù)用戶自定義氣體。如果質(zhì)譜儀要監(jiān)視多個生物反應(yīng)器，可以在多流路之間進行快速切換。Thermo Fisher Scientific 開發(fā)了獨特的快速多流路進樣器（RMS），可快速選擇多達 64 個流路的樣品。

美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在生物醫(yī)藥生產(chǎn)領(lǐng)域發(fā)起Quality by design (QbD)， 要求通過采用過程分析技術(shù)（PAT），多變量數(shù)據(jù)分析（MVDA）等技術(shù)高效確定最佳工藝條件，以減少時間成本。因此，細胞培養(yǎng)工藝需要更多的在線分析。應(yīng)該注意的是氣體大致上包括進出生物反應(yīng)器的任何氣體，而不僅限于氧氣和二氧化碳。傳統(tǒng)上二氧化鋯傳感器用于氧氣濃度測定，紅外傳感器用于二氧化碳濃度的測定。與質(zhì)譜（MS）相比，這些技術(shù)對氣體的檢測范圍有限，靈敏度較低。雖然質(zhì)譜操作更為復(fù)雜，但可以一臺設(shè)備檢測和定量除了氧氣和二氧化碳的多種氣態(tài)化合物。以前在哺乳動物細胞培養(yǎng)中已成功使用MS進行氣體分析。哺乳動物細胞培養(yǎng)過程進氣速率，尤其是在小型反應(yīng)器上進氣速率通常遠低于微生物發(fā)酵，有時接近質(zhì)譜儀樣品入口的最低要求（10mL/min）。

這可能需要更長的樣本流切換時間，幸運的是哺乳動物細胞培養(yǎng)非常長的批處理時間和更低的呼吸速率往往不需要很高的頻率分析。在這項研究中，數(shù)據(jù)來自每個樣本流每分鐘一次的頻率是令人滿意的。

在哺乳動物細胞發(fā)酵中，進氣成分是經(jīng)常變化的混合物（例如，氮氣，氧氣和二氧化碳）。二氧化碳的含量從接近零到100％，這就要求氣體分析質(zhì)譜儀具有非常寬的動態(tài)監(jiān)測范圍，并且在如此寬的范圍內(nèi)都穩(wěn)定呈線性。由于哺乳動物細胞的低呼吸率，與入口氣體進行比較，出口氣體中的氧氣、二氧化碳濃度，產(chǎn)生的差異小得多，這要求氣體分析光譜儀必須具備短期精度很高的測量，可以觀察到這些很小差異, 從而得到有用的氧氣吸收率（OUR），二氧化碳釋放速率（CER）和呼吸商（RQ）。由于使用碳酸氫鹽作為pH值緩沖，加上二氧化碳易溶于水，因此測定二氧化碳的變化很難。應(yīng)用質(zhì)譜法可以更有效地進行氣體分析, 用質(zhì)量平衡原理，側(cè)重于二氧化碳的和氧氣（細胞呼吸成分）的檢測，并將其與氣體利用聯(lián)系起來。

應(yīng)用圖釋：

△圖片來源：HaiYuan Goh et al，Applications of of gas mass spectrometry in fed batch mammalian cell culture,Bioprocess and Biosystems Engineering. doi:10.1007/s00449-019-02242-2

MS檢測原始氣體數(shù)據(jù)得出以下參數(shù)：

氧氣吸收率（OUR），kLa（對于O2），比耗氧率（qO2），二氧化碳釋放速率（CER），比二氧化碳產(chǎn)量率（qCO2）和呼吸商（RQ）。

F_bioreactorin是進入生物反應(yīng)器的氣體流量，單位為mL/min；F_{bioreactor out}從生物反應(yīng)器中流出的氣體流量,單位為mL/min；F_MS，_in氣體流入MS分析儀的流量，單位為mL/min；V_bioreactor生物反應(yīng)器中培養(yǎng)體積；[O₂*]進氣中的氧氣濃度以μmolL^-1為單位；[O₂]反應(yīng)器中的氧氣濃度以μmolL^-1為單位；VCC，細胞活力，cell/mL；OxC和CDC是從與MS相關(guān)聯(lián)的GasWorks軟件獲得的派生參數(shù)信息。這些信息是使用如下公式 （7–14）得出的 ：

結(jié)果和討論

圖3

從樣本中進行例行采樣（用于離線分析），5 L和50 L反應(yīng)器的采樣量分別為20 mL和30 mL。相比培養(yǎng)體積，取樣體積對于尾氣分析的影響可以忽略。消泡劑和補料的添加都會引起輸入氧氣的激增，CO₂ 和 N₂成比例降低。這個現(xiàn)象也說明消泡劑的加入會降低體積氧傳遞系數(shù)。

有趣的是，還檢測到了在細胞培養(yǎng)過程中兩個事件。首先，在5 L規(guī)模的生物反應(yīng)器中，MS檢測到濾器堵塞。MS軟件在夜晚接收檢測信號，沒有操作員在場。經(jīng)早上檢查MS記錄數(shù)據(jù)，確定濾器堵塞。在無菌條件下更換過濾器后培養(yǎng)照常進行。這樣的故障沒有來自MS的實時氣體數(shù)據(jù)就不會發(fā)現(xiàn)。第二，在50L培養(yǎng)過程中,  在某些情況下，生物反應(yīng)器壓縮空氣供應(yīng)失效，氣體質(zhì)譜儀檢測到氣體組成成分的變化。當壓縮空氣供應(yīng)減少，50 L 反應(yīng)器控制系統(tǒng)能夠切換到不同的氣體混合物以保證DO。也就是將由純氧而不是通常的壓縮空氣輔以氧。而這時DO的讀數(shù)沒有變化。這意味著此種情況下，使用氣體MS分析儀將有助于對細胞培養(yǎng)過程的有效追蹤。針對5 L和50 L反應(yīng)器的整個培養(yǎng)周期，計算了OUR 、k_La和q_O2。5和50 L生物反應(yīng)器運行合并數(shù)據(jù)圖4所示，顯示在不同的規(guī)模上不同參數(shù)的趨勢。

圖4

圖4、從重復(fù)運行5 L STR和單個50 L SUB運行得出的氧氣相關(guān)參數(shù)。A. OUR值; B. 在添加消泡劑后的kLa值; 

在5 L和50 L反應(yīng)器上，O_2-in數(shù)據(jù)如圖4a所示，表明O_2-in與VCC峰相關(guān)，如圖3d所示。因為O_2-in隨著氧氣消耗量（或OUR）的增加而增加，當存在更多細胞時，氧氣消耗量會繼續(xù)增加，反之亦然。5 L和50 L的運行的VCC與O_2-in之間的相關(guān)性全都約為0.9（圖5a）。根據(jù)VCC-OUR數(shù)據(jù)， 50升反應(yīng)器的r²值為0.710， 5 L的r2值為0.440和0.338。這可能是由于生物反應(yīng)器的體積的不準確和VCC測量缺乏足夠數(shù)據(jù)點，另外從5 L系統(tǒng)生成的數(shù)據(jù)OUR的干擾較大。這也表明O_2-in將成為細胞培養(yǎng)中VCC變化的更可靠的在線指標，可能是工藝控制中更好的參數(shù)。

圖5

圖5來自兩個5 L罐和50 L SUB的VCC和氣體數(shù)據(jù)的相關(guān)性。A. VCC與O_2-in; B. VCC與OUR氧氣利用率。

k_La可以從生物反應(yīng)器進口和出口的已知氣體流量、氧氣濃度計算。k_La數(shù)據(jù)表明5 L生物反應(yīng)器（?14 h^-1）中的初始k_La高于50 L生物反應(yīng)器（?7.5 h-¹）。尾氣分析能夠捕捉到消泡劑導(dǎo)致k_La降低。消泡劑導(dǎo)致k_La下降在5 L運行中也可以觀察到，盡管兩次重復(fù)之間不一致（圖4b）。另外，隨著反應(yīng)器的變化，k_La變化沒有很大差異，即使在50升反應(yīng)器增加了一個攪拌槳。

不同生物反應(yīng)器的q_O2趨勢是一致的（圖4c）。對于培養(yǎng)的前半部分，維持相對恒定的q_O2，而在培養(yǎng)的后半部分觀察到q_O2相對較高。一種解釋這種變化的假設(shè)是代謝從乳酸生產(chǎn)轉(zhuǎn)向消耗。在乳酸迅速積累的時期，糖酵解是細胞的主要途徑，需要相對較低氧氣量。向乳酸消耗的轉(zhuǎn)變可能標志氧化磷酸化，需要氧氣作為最終的電子供體。因此，在乳酸轉(zhuǎn)變?yōu)榧兿男袨闀r，q_O2變得相對較高。這分別在50 L運行第7天和5 L運行第9天之后觀察到（圖4c）。這幾天里也發(fā)生一致相應(yīng)的乳酸代謝變化（圖3h）。有趣的是，從第10天開始以后，在5 L培養(yǎng)中q_O2的值是50 L的約3倍，即使50 L細胞密度平均更高。它暗示也許5 L系統(tǒng)中有一個不同于50 L系統(tǒng)的的生理環(huán)境，導(dǎo)致更高的q_O2。

圖6

圖6、呼吸商圖形分布，在兩次5 L和一次50 L SUB運行期間，由尾氣計算，乳酸產(chǎn)生階段和乳酸消耗階段，以黃色和綠色突出顯示。A. 50 L 的RQ; B. 5L的 RQ。

應(yīng)注意的是，在沒有二氧化碳進到生物反應(yīng)器中的時期，在尾氣中檢測到CO₂（圖3e–g）。尾氣中最高二氧化碳的比例為?2％mol。系統(tǒng)產(chǎn)生的二氧化碳可能是由于來自細胞呼吸釋放的二氧化碳。CER和q_CO2僅在此特定時期內(nèi)計算，因為有些階段沒有外部二氧化碳進入到生物反應(yīng)器中。q_CO2似乎在兩個不同規(guī)模的3個不同反應(yīng)器中具有一致性，?5 pmol / cell / day。這些數(shù)據(jù)和Goudar等人報道一致。

RQ與細胞培養(yǎng)代謝狀態(tài)之間的關(guān)系。RQ可以用作細胞培養(yǎng)代謝狀態(tài)的變化指標。來自MS的氣體數(shù)據(jù)能夠提供實時RQ數(shù)據(jù)（圖6）。顯然， 如前所述，由于添加補料和消泡劑的結(jié)果引起的氣體峰值，在圖4b中，也影響了RQ。重復(fù)的兩次5 L反應(yīng)器的RQ峰（圖6b）并非完全相同。這可能標志在將氣體輸送到每一個5 L生物反應(yīng)器中的方式上存在實際的物理差異。主要可能是氣流量，進入生物反應(yīng)器和進入MS改變的氣體需求引起波動。另外，兩個反應(yīng)器都由串聯(lián)的相同氣源供給，所以進氣流量變化的影響可以根據(jù)每個反應(yīng)器所要求的氣體而變化。這些數(shù)據(jù)干擾項在50升系統(tǒng)中的問題較少，使RQ圖形更易解釋。乳酸的代謝（生產(chǎn)或消耗）狀態(tài)和每個代謝過程中的近似平均RQ值之間顯示了相關(guān)性。50 L反應(yīng)器比5 L更加明顯。如果忽略補料和消泡劑添加對RQ的影響，平均RQ值在乳酸生產(chǎn)階段為> 1，而乳酸消耗階段為<1（圖6a）。單純利用碳源（如葡萄糖）的 RQ值為1，同時氧化更多還原性分子（如氨基酸）和脂肪酸會導(dǎo)致RQ <1，因為需要更多的氧氣來完全氧化這些分子。在乳酸生產(chǎn)階段，糖酵解是主要的代謝途徑，高的比葡萄糖消耗率（數(shù)據(jù)未顯示）和相對較低的q_O2，因此RQ更高。另一方面，在乳酸消耗階段，TCA活性較高涉及的氧化磷酸化導(dǎo)致更低葡萄糖消耗率（數(shù)據(jù)未顯示）及相對較高的q_O2，最終導(dǎo)致較低的RQ。以前在搖瓶和深孔板實驗中已經(jīng)證明，這種在高和低的糖酵解與產(chǎn)生乳酸和消耗乳酸之間的相關(guān)性。對200多個具有產(chǎn)生乳酸/消耗乳酸的生物反應(yīng)器數(shù)據(jù)的多元分析表明，相對于其他任何參數(shù)，乳酸的產(chǎn)生到消耗轉(zhuǎn)變更多與糖酵解能量流降低有關(guān)。

氣體分析的潛在應(yīng)用

尾氣MS分析儀有潛在的多種應(yīng)用，可能包括：

1. 磁質(zhì)譜可以檢測非典型氣體成分像硫化氫（H₂S，低至ppm范圍），并用作細胞代謝壓力或產(chǎn)品質(zhì)量屬性的指標。

2. 盡早發(fā)現(xiàn)基于氣體分析的微生物污染，可以最大程度地減少批次終止的決策時間。

3. 預(yù)定質(zhì)量標準范圍內(nèi)評估批次之間的差異，有利于在不同生產(chǎn)地點和生物反應(yīng)器平臺進行技術(shù)轉(zhuǎn)移。

結(jié)論

綜上所述，使用磁質(zhì)譜進行氣體分析成功在5 L和50 L進行分批補料的哺乳動物細胞培養(yǎng)實現(xiàn)。實時進氣中氧氣百分比mol分壓與不同細胞培養(yǎng)階段的相關(guān)性很好，尤其是VCC。觀察到培養(yǎng)物中的乳酸和尾氣二氧化碳分壓之間負相關(guān)的關(guān)系。在整個培養(yǎng)持續(xù)周期內(nèi)，僅從尾氣數(shù)據(jù)中可以計算k_La 。此外，可以從氣體分析中可以發(fā)現(xiàn)影響kLa的特定動作，例如消泡劑的添加。最后，觀察到的RQ 足以顯示培養(yǎng)期間乳酸的生產(chǎn)/消耗階段的相關(guān)性。預(yù)計這些技術(shù)仍然適用于工業(yè)GS-CHO細胞系。

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